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基于双向电泳图谱的心绞痛血瘀证蛋白质组学研究 冠状动脉硬化是中国人民最重要的原因。据统计,在冠心病住院患者中,60%首要表现是不稳定性心绞痛(Unstable Angina,UA)。UA已经成为心血管内科最常见的综合征之一,研究冠心病不稳定性心绞痛的防治成为临床亟需解决的一个重大课题。血瘀证是心绞痛中常见的中医证候表现。目前,心绞痛的发病机制仍然不完全清楚,尚无早期诊断的特异性标志物。近年来,随着蛋白质组学技术的飞速发展,为研究心绞痛的发病机制和探索早期诊断的生物标记物提供了新的思路和技术平台。由于在心绞痛发生、发展过程中,有许多炎症细胞因子以及有关信号通路的小分子蛋白参与,这些蛋白质在心脏中的变化必然会通过相应的途径释放至血液,引起其在血液中的浓度变化,同时也会级联其他一些相关蛋白质发生相应变化,从理论上为心绞痛的血浆差异蛋白质组学研究提供了依据。本研究采用双向凝胶电泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱(Matrix-assist ed laser desorption/ionization time of flight mass spec trometry,MALDI-TOF-MS)技术对心绞痛血瘀证患者血瘀证程度变化前后的血浆进行比较蛋白质组学研究,寻找心绞痛血瘀证的相关蛋白,为进一步寻找心绞痛血瘀证的药物靶点以及探索心绞痛血瘀证的病理机制创造条件。 1 临床数据 1.1 患者心绞痛疗效 8例心绞痛住院患者均来自北京中医药大学东直门医院,其中男4例,女4例,平均年龄67±8岁。8例患者均有发作性心前区疼痛,服用硝酸甘油或等效品缓解,心电图示T波改变,心肌酶不高,确诊为“冠心病不稳定性心绞痛”,中医辨证为气虚血瘀,并有阴虚症状。入院两周后主诉:心绞痛未再次出现或症状减轻,发作频率减少,持续时间缩短。都在两次采血期间服用了活血化瘀中药。 1.2 不稳定性心绞痛诊断和治疗建议标准 均符合美国心脏病学院/美国心脏学会/美国医师学院及美国内科学会联合议定的《慢性稳定型心绞痛诊疗指南(1999年)》以及中华医学会心血管病学分会2000年制订的“不稳定性心绞痛诊断和治疗建议”标准。血瘀证诊断符合2002年国家食品与药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》以及《冠心病中医辨证标准》。 1.3 中医病因病:主要有3个月内 排除急性心肌梗死、心肌炎、心脏神经官能症、肋间神经痛患者;其他疾病引起的心绞痛,如风湿热、梅毒、先天性冠脉畸形、肥厚型心肌病、主动脉瓣狭窄或关闭不全者;合并有脑中风、糖尿病、肺部感染、肾炎、肾功能衰竭、泌尿系感染、风湿病;肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重疾病及骨关节病者;妊娠期或哺乳期患者,过敏体质患者。 2 材料和方法 2.1 血清edta抗凝 8例患者均于入院2天内及血瘀证程度变化后,分别取清晨空腹肘静脉血2 ml,EDTA抗凝,4℃,3000转/min,离心10 min。取上清,分装,-80°C保存。 2.2 试剂和试剂 p H值4-7固相PH梯度干胶条(IPG)、IPG buffer(p H4-7)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、矿物油、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、考马斯亮蓝R350购自美国GE公司,过硫酸铵(AP)、琼脂糖(Agarose)、甘氨酸(Glycine)购自美国Amresco公司,其它试剂购自北京试剂公司。实验用水为Milli-Q去离子水。 2.3 仪器、设备和测试设备 Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪、Ettan DALT six双向垂直电泳仪、Multi TempⅢ温控循环水浴、EPS601电源,均为美国GE公司产品。质谱仪为bruker公司Ultraflex tof/tof。 2.4 分析软件 Imagemaster 2D Platinum 6.0,GE healthcare。 2.5 蛋白质上样和上样 参照Amersham公司双向电泳手册和Gorg等方法进行。采用IPG预制胶条24 cm p H值4-7。用Bradford法进行蛋白定量,再用水化液调整到合适浓度后上样。蛋白质上样量1mg,梯度升压,等电聚焦总伏小时为100k Vh。平衡后胶条转移至13%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS)上进行第2相电泳。16℃恒温,采用恒功率电泳,开始时2.5W/gel,1Hr;再用15W/gel至溴酚蓝到达凝胶的底部边缘。每个样本至少重复电泳3次,以保证实验的稳定性。 2.6 那是凝胶 电泳结束后,凝胶固定过夜,R 350染色液加热至90℃染色10min,脱色至背景透明。 2.7 凝胶的点检测及匹配 凝胶通过UMAX 2100X