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邻苯三酚超氧阴离子自由基的制备及应用 关于三酚自氧化反应测定sod活性的光度法有许多关于三酚自氧化反应的报道，包括经典的三酚法、改进的三酚法和最终剂法。由于三酚在tris-hcl（ph8.30）缓冲溶液中可产生自氧化反应，并产生具有超氧阴离子自由基的超氧基（o-2）。其自氧化产物有两个还原波。c.0996v和1.44v（sce）。在这项工作中，我们提出了一种方法来测量三酚自氧化产生的电离作用，并研究了黄酮类化合物对三酚自氧化产生的氧化反应。此方法所用仪器便宜,操作简便,试剂易得,对于抗氧化剂的筛选具有一定的应用价值。 1 实验方法 1.1 实验用黄酮类化合物 MP-1型溶出分析仪(山东电讯七厂);三电极系统:滴汞电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极;PH-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。 邻苯三酚(使用前升华提纯)标准液:5×10-3mol/L,pH 7.10～9.20三羟甲基氨基甲烷(Tris)- HCl缓冲溶液(使用前均被空气饱和),SOD(Sigma 公司)3730units/mg solid,实验所用黄酮类化合物均购自北京生化试剂公司;黄酮类化合物在测定前用0.1mol/L NaHCO3溶解,其他试剂均为分析纯,试验用水为二次亚沸石英蒸馏水。 1.2 实验方法 1.2.1 edta的二次蒸馏 取5.0mL100mmol/L Tris-HCl缓冲溶液,0.4L 0.05mol/L的EDTA,加入一定量的二次蒸馏水,在25℃ 恒温槽中恒温25min,加入一定体积的邻苯三酚,使总体积为10mL,迅速混匀后,倒入电解池中, 记录-0.96V和-1.44V处极谱峰高随时间的变化,即每隔1min读取峰电流一次。 1.2.2 sod活性的测定 采用1.2.1的方法,在加入邻苯三酚之前,先加入一定量的SOD,使总体积为10mL,迅速混匀后,倒入电解池中, 记录-0.96V和-1.44V处极谱峰高随时间的变化,即每隔1min读取峰电流一次。按照下式计算SOD活性,SOD百分抑制率(P)= (i0-i)/i0×100%,i0为未加SOD时邻苯三酚自氧化峰电流随时间的变化,i为加入SOD后峰电流随时间的变化。设反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活性单位,SOD活性(U/mL) = P×反应液总量(mL)×样品稀释倍数/(50%×取液量)。 2 结果与讨论 2.1 亚硫酸钠和通氮气除氧对二阶导数波的影响 在pH8.30的Tris-HCl缓冲溶液中,邻苯三酚发生自氧化反应,-0.96V和-1.44V处的二阶导数波随时间延长而增高(见图1)。如果加入亚硫酸钠或通氮气除氧,则无上述现象发生。-0.96V和-1.44V处的峰与溶液中的溶解氧有关。 2.2 不同缓冲溶液对邻苯三酚的自氧化反应 固定邻苯三酚的浓度,试验发现邻苯三酚在0.1mol/L的NaHCO3、0.2mol/L NaHCO3、0.05mol/L KH2PO4-NaHPO4(pH8.30)和Tris-HCl(pH8.30)缓冲溶液中均可发生自氧化反应,其中在50mmol/L Tris-HCl(pH8.30)的缓冲溶液中邻苯三酚的自氧化产物的还原信号最强,且SOD抑制邻苯三酚自氧化的灵敏度最高,因此实验选择50mmol/L Tris-HCl(pH8.30)的缓冲溶液作为底液。 2.3 edta与三酚自氧化产物的相互作用 由于Fe2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Zn2+等金属离子可明显地催化邻苯三酚的自氧化,其中Fe2+、Cu2+和Mn2+会使邻苯三酚自氧化产物的信号增加约1.3倍。如果加入EDTA可消除此影响。实验发现EDTA存在下,邻苯三酚自氧化速率与EDTA的浓度无关,且消除金属离子对邻苯三酚自氧化的影响,试验在邻苯三酚自氧化体系中0.05mol/LEDTA在0.05至0.4mL之间对金属离子的抑制作用,发现加入0.1mLEDTA时可以抑制金属离子的影响,故本文选择向溶液中加入0.2mL 0.05mol/L的EDTA消除金属离子的干扰。 2.4 自氧化速率的测定 实验结果表明,温度对邻苯三酚自氧化速率的影响远比pH小得多,在23.5～27.5℃范围内,邻苯三酚的自氧化速率基本不变,这点给测定带来方便。实验选择在25℃恒温25min。 2.5 邻苯三酚对邻苯三酚的氧化机理 不同的邻苯三酚浓度对自氧化速率有影响,但邻苯三酚浓度对其自氧化速率的影响小于pH的影响。随着邻苯三酚浓度的增大,其自氧化速率增大。邻苯三酚自氧化速率与其浓度在0～0.3 mmol/L 范围内成一定的线性关系(见图2),由于浓度太小,邻苯三酚自氧化线性速率变小,浓度太大,SOD对邻苯三酚自氧化抑制的灵敏度降低。所以,测试体系中邻苯三酚浓度为0.2mmol/L。 2.6 so