易通过冷冻食品传播的新冠病毒解旋酶的表达纯化及酶活研究.docx

? ? 易通过冷冻食品传播的新冠病毒解旋酶的表达纯化及酶活研究 ? ? 李海红，郑亚婷，高 博，韩晓睿，何怡宁， 侯锡苗 （西北农林科技大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室，陕西 杨凌 712100） 2019年12月下旬爆发的新型冠状病毒（SARSCoV-2）导致了冠状病毒疾病COVID-19，SARSCoV-2被世界卫生组织报道成为全球范围内的大爆发，它的持续爆发已经给世界各地的人类生命和经济造成了巨大损失。随着近期全国多地的海关部门在冷冻食品中发现新冠病毒，此前武汉、北京、大连等多地的农贸及海鲜市场都曾检测到新冠病毒，这表明新冠病毒对人类食品安全产生重大的威胁。 冠状病毒属（Coronavirus）在系统分类上属于套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）[1]。冠状病毒属的基因组为线性单股正链RNA，基因组全长26-31kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒[2]，其基因组编码16种非结构蛋白，命名为Nsp1-Nsp16[3]，其中RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）、RNA解旋酶（Nsp13）及复制辅助因子（Nsp7、Nsp8）组装成高效的RNA合成机器，该RNA复制体是病毒存活的核心部件，对病毒复制至关重要[4]。 由于Nsp13在所有冠状病毒物种中的高度保守性，被作为理想的抗病毒靶点[5-7]。有研究表明，SARS-CoV的Nsp13，具有NTP水解活性[8]，可以水解所有类型的NTP，以NTP依赖的方式解开双链DNA和RNA，解旋的极性是5-3[9]。尽管是RNA解旋酶，但是Nsp13大约以相同的速率解旋RNA和DNA底物[10]。与其他解旋酶相比，Nsp13解旋酶的解旋效率较低，但可能通过不同的机制增强，如通过协同作用或者与病毒的RdRp相互作用[11-12]，除解旋酶活性外，Nsp13被认为还具有RNA-5-三磷酸酶活性，该活性可能在mRNA加帽中发挥作用。有研究表明，SARS-CoV-2的Nsp13解旋酶具有解旋DNA、RNA双链的作用[9]。 研究表达并纯化了高纯度的SARS-CoV-2-Nsp13蛋白，对其与RNA和DNA底物的结合及解旋双链DNA的能力进行了探究，研究结果可为理解SARSCoV-2的复制机理提供参考和支持。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 原料 质粒与菌株pET21a-HMT表达载体和大肠杆菌菌株2984、BL21（DE3），均为实验室保存。 1.1.2 试剂及仪器 Buffer A：25 mmol/L Tris-HCl溶液pH值8.0，500 mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑；新冠病毒（SARSCoV-2）Nsp13蛋 白 编 码 序 列（SARS-CoV-2-Nsp13），Bio Matik公司提供；限制性内切酶EcoRI和XhoI，Takara公司提供；Ni-NTA Resin，QIAGEN公司提供；Heparin柱，GE Healthcare公司提供。 高压破碎仪，JNBIO公司产品；AKTA purifier型蛋白纯化仪，GE Healthcare公司产品。 1.1.3 DNA底物 寡聚核酸链，生工生物工程（上海）股份有限公司提供。结合试验及解旋试验的底物标记有荧光素（Fluorescein，F）。底物的退火方式为寡聚核酸链按照摩尔比为1∶1的比例混合，95℃下加热5 min，然后缓慢降至室温。 结合及解旋试验中所用的DNA底物见表1。 1.2 试验方法 1.2.1 载体构建及蛋白质的表达与纯化 产物经EcoR I和Xho I酶切后，连入pET-21a-HMT载体中，重组质粒经酶切鉴定及测序确认无误后，转入BL21（DE3）表达菌株进行蛋白质表达。37℃下培养至菌液吸光度A600约为0.6 h，加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG（Merck），18℃下诱导16 h，收集菌体。用缓冲液悬浮菌体，并用高压细胞破碎仪破碎菌体。高速离心收集上清后，先利用Amylose亲和层析柱进行初步纯化，使用Elute Buffer（25 mmol/L Tris-HCl pH值8.0，200 mmol/L NaCl，5% Glycerol，0.5% Maltose）洗脱后，蛋白洗脱液稀释降盐后再利用Heparin Sepharose Fast Flow亲和层析柱进一步纯化。纯化产物通过10% SDS检测纯度，合并较纯组分并使用30 kD的Millipore超滤管离心浓缩，分装后立即用液氮速冻，保存于-80℃下备用。 1.2.2 SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶的DNA、RNA结合活性测定 利用荧光偏振原理，测定SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶与单荧光标记底物发生结合反应时的荧光各向异性的变化。反应体系1