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辛硫磷对小鼠遗传毒性的研究 有机磷农药是目前使用最大的农药。在控制病虫害的同时，它不可避免地会在农产品上留下残留。据报道,我国农产品中的农药残留污染严重,超标率远高于日本、美国等发达国家。辛硫磷(phoxim)化学名称为O,O-二乙基-O-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯,是一种高效、低毒、击倒力强、残留期短的广谱有机磷杀虫剂。随着甲胺磷等高毒有机磷农药逐渐被禁止使用,辛硫磷在农业生产中的使用量呈上升趋势,2005年就达到百万吨以上。据报道,辛硫磷对雄性哺乳动物具有生殖毒性,可造成大鼠精子数量减少、活动度降低,畸形率升高。而关于其对哺乳类动物遗传毒性的报道较为少见。因此,本研究首次采用单细胞凝胶电泳试验与小鼠骨髓细胞微核试验相结合的方法,评价辛硫磷对小鼠的遗传毒性,为揭示有机磷农药的毒性作用机制提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 rad650型酶标仪 DYCP-31E型水平电泳仪(北京六一仪器厂),E200型荧光显微镜(日本尼康公司),Bio Rad680型酶标仪(美国伯乐公司)。辛硫磷(40%乳油,山东东泰农化有限公司),琼脂糖、肝素钠、台盼蓝(0.04%)、溴化乙啶(EB,1μg/ml)均购自美国Sigma公司,Tris(台湾生工有限公司)。 1.2 动物分组及分组 选择健康SPF级昆明小鼠60只,体重在20~24 g之间,雌雄各半,购自新乡医学院动物实验中心,动物合格证号为2010-007。实验室温度为(25±2)℃,相对湿度为50%~55%,明暗比为12 h∶12 h。试验期间,动物可自由摄食、饮水。 适应性饲养7 d后,以辛硫磷对小鼠半数致死剂量(LD50)为依据,在预试验的基础上,将小鼠随机分为6组,分别为阴性对照(生理盐水)组和10、20、40、80 mg/kg辛硫磷染毒组以及阳性对照组,每组10只,雌雄各半。采用灌胃方式进行染毒,染毒容量为10 ml/kg,每日1次,连续染毒14 d;而阳性对照组采用腹腔注射方式给予环磷酰胺(40 mg/kg),每日1次,连续2 d。染毒过程中,定期测量并记录小鼠体重。 1.3 微核试验方法 染毒结束后,将小鼠脱颈椎处死,取下小鼠两侧股骨,参照史志诚等的方法进行微核试验。每只小鼠观察1 500个细胞,计数含微核的细胞数,并计算微核率(微核率=微核细胞数/细胞总数×1 000‰)。 1.4 细胞活力及细胞拖尾率 取外周血约0.2 ml,加入等量Hanks液充分混匀,将外周血混合液用滴管沿管壁缓慢加入预先加有0.2 ml淋巴细胞分离液的1 ml离心管中,离心后,用毛细管插到云雾层,吸取淋巴细胞,用适量PBS将淋巴细胞浓度调整到104~105/ml。采用MTT试验观察细胞的存活情况,细胞的存活率在95%以上。 参照1988年Singh等的方法进行单细胞凝胶电泳试验。电泳后,经EB染色,用荧光显微镜(波长为515~560 nm)观察。每件样本随机观察40个细胞图像,每组观察10件样本,即每组观察400个细胞,对DNA损伤的程度进行分级,分级标准为:无损伤(0级)、轻度损伤(1级)、中度损伤(2级)、重度损伤(3级)、完全损伤(4级)。参照赵影的方法,计算细胞拖尾率(细胞拖尾率=出现拖尾细胞数/细胞总数×100%)和DNA损伤专用单位。 DNA损伤专用单位是一种衡量DNA链损伤程度的特有单位,是将不同的分级加以换算统计,得到DNA损伤的总体水平。其计算方法:DNA损伤专用单位=(0×0级细胞数+1×1级细胞数+2×2级细胞数+3×3级细胞数+4×4级细胞数)/细胞总数。 2 结果 2.1 大鼠体重测量的结果 表1、2可见,各辛硫磷染毒组雄性、雌性小鼠体重与阴性对照组相比,差异均无统计学意义。 2.2 辛硫磷对小鼠骨髓细胞微核形成的影响 辛硫磷对雄性和雌性小鼠的微核诱导作用表现出一致性。辛硫磷染毒小鼠骨髓细胞微核率的变化见表3。 表3可见,与阴性对照组比较,10和20 mg/kg辛硫磷染毒组小鼠的骨髓细胞微核率略有升高,但差异均没有统计学意义;40和80 mg/kg辛硫磷染毒组小鼠的骨髓细胞微核率显著升高,差异均有统计学意义(P0.05)。随着辛硫磷染毒剂量的升高,小鼠的骨髓细胞微核率均呈上升趋势。说明辛硫磷对小鼠骨髓细胞微核发生具有诱导作用。 辛硫磷染毒小鼠骨髓微核细胞病理图见封三图1。 阴性对照组小鼠骨髓细胞核为圆形;辛硫磷染毒后小鼠骨髓细胞形成的微核为圆形或椭圆形,大小在主核的1/5以下,微核的染色深度与主核一致或略浅于主核(封三图1)。 2.3 辛硫磷染毒小鼠外周血淋巴细胞dna损伤的荧光显微镜 辛硫磷对雄性和雌性小鼠的DNA损伤作用表现出一致性。辛硫磷染毒对雄性、雌性小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤的变化分别见表4、5。 表4、5可见,各剂量辛硫磷染毒组小鼠外周血淋巴细胞的拖尾率和DN