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中药体外抑菌评价方法及存在问题 在抗感染治疗中，细菌耐药性和抗生素的副作用严重困扰着医学科学。仅仅通过药物治疗，这个问题就无法解决。经研究发现, 天然来源的中草药不仅具有较强的抗菌作用, 还具备不易产生耐药、经济等优点, 已成为国内外研究热点。 体外抑菌研究方法是抗感染药研究过程中的一个重要环节, 广泛应用于药物筛选、活性物质追踪、抗菌谱效价测定及临床上药敏试验等工作中, 是直接评价药物抗菌效能的经典实验方法。由于过去对这方面的认知不足和研究方法单一, 严重影响了中药的开发和运用。随着越来越多具有抗菌作用的天然植物药被国内外学者发现报道, 医药界越来越重视从天然产物中寻找抗菌药物资源, 而经历几千年临床验证的中草药重新回归到人们的研究视野。研究者不断地将国际公认的西药抗生素敏感实验方法 (扫描电镜、琼脂稀释法等) 引入到中药的抑菌作用研究中, 并根据其自身特点不断地进行改良, 逐渐趋于更科学、合理、准确、可靠。但由于种种原因, 缺乏对中草药抑菌方法的深入研究, 以致目前尚无完善的、能体现中药自身特色的体外抑菌评价方法。这不仅给研究者带来困扰, 还严重影响了抗感染中药的发展。本文就目前所采用的中药体外抑菌研究方法及存在的问题进行评述, 力图为新药开发提供借鉴和参考, 以期建立既能体现中药自身特色, 又能表现出准确性高、重现性好的标准化评价方法。 1 其他法 琼脂扩散法主要包括滤纸片扩散法、牛津杯法、挖沟法、打洞 (孔) 法等。琼脂扩散法具有方法简便, 易掌握的优点, 但精确度不高, 一般用于定性或初步判断其作用的强弱。 1.1 抗菌药物敏感试验 滤纸片法是抑菌实验中最常用的方法, 通过量取抑菌圈直径来判断试验药物抑菌作用的强弱。该法的特点是精确度虽不高、药物在滤纸片上的装载量小, 但可以在同一平皿上观察一种细菌对多种中药成分的敏感度或耐药性, 结果直观, 易于判断、比较。 杨钧等采用纸片扩散法观察中药复方清热颗粒剂以10 倍临床剂量 (22 g/ (kg·d) ) ig给药对细菌耐药性的影响, 结果末次给药60 min后含药血清抑菌环直径达10 mm。付婷婷等通过纸片法初筛出金黄色葡萄球菌对苦参醇提物非常敏感, 而黄柏等提取液抑菌活性一般。认为使用纸片扩散法可以观察一种细菌对多种中药成分的敏感度, 可筛选对病原微生物活性高、特异性高、对环境稳定的中药。 但常规纸片法不够准确, 尤其是在做中药抑菌试验时, 中药提取液普遍为悬浊液, 成分复杂, 部分抑菌活性成分具有挥发性, 对热敏感, 纸片浸泡时间以及在其干燥过程中所导致的药物挥发、纸片装载量有限等因素往往会影响试验结果的准确性。基于扩散法与稀释法的原理和特点的E实验 (E-test) 弥补了常规纸片法的一些不足, 可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试菌的最小抑菌浓度 (MIC) , 且结果准确、重复性好。但是目前E实验较多应用于抗生素研究, 由于中药与抗生素相比, 其抗菌活性较低, 需要用较大的药量才能达到相同的效果, 要在塑料薄条背面固定一系列预先制备的干燥而稳定的连续指数浓度梯度的抑菌中药有难度, 因此E实验在中药抑菌应用方面还处于起步阶段。 1.2 中草药提取液的筛选 牛津杯法 (管碟法、杯碟法) 是国内外常用的检测法, 此法检测药物抑菌作用, 具有直观、载药量多、重复性好等优点;但需要特制的牛津杯, 操作需非常小心, 否则易造成牛津杯在琼脂平板表面滑动, 药物向菌层中渗透扩散不均匀, 得到的抑菌圈不规则。 陈志蓉等采用牛津杯抑菌圈法定性检测10种常见中药大黄、艾叶、丁香、黄柏、苦参、蒲公英、蛇床子、仙鹤草、茵陈、姜黄提取液1 g/m L对痤疮致病菌的抑菌活性。结果所选10 种中草药提取液对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌呈现部分抑制作用。表明采用牛津杯法可以在较短的时间内完成大量中草药的筛选。李国利等用牛津杯法测研究荷叶铁线蕨提取液1 g/m L的抑菌作用, 其对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌抑菌圈直径分别为12 mm和21 mm, 对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌无抑菌作用。牛津杯法的结果主要取决于琼脂培养基内的药物扩散性和抗菌有效成分的溶解性, 是初步筛选抗菌植物药的有效途径, 可作为一种定性的研究方法。 1.3 肺热清解口服液 挖沟法可在一个平板上试验一种药物对几种不同试验菌的抗菌作用, 适用于不易溶解的中药或外科敷用中药粉末等, 刘佩沂等采用挖沟法比较肺热清解口服液与处方中总黄酮的抗菌效果。总黄酮在高浓度 (原药材4 g/m L) 时, 对肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌等抑菌效果均优于肺热清解口服液, 但在低浓度 (原药材1 g/m L) 时抑菌效果弱于肺热清解口服液。采用挖沟法克服了不溶性药物难以观察结果的难题, 但对操作技术有要求, 操作不当药液易渗出。 1