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中药冬虫夏草的鉴别研究 甘草是麦角菌科的一种真菌甘草。寄生虫位于蝙蝠科昆虫虫的头部和幼体的干燥部位。它是新的。它具有补充肺、益肾、止血和粘液的功效。治疗肺虚、咳嗽、出血和地方志。它是我国著名的预防疾病之一。冬虫夏草的生长环境独特, 分布区域有限, 仅产于我国西藏、青海、四川西部及甘肃南部地区海拔3 000米以上的高原地带, 生长周期2 ~3年, 目前尚没有实现人工栽培。由于有限的野生资源与巨大的市场需求, 冬虫夏草成为我国目前价格最为昂贵的名贵滋补中药。资源短缺也导致药用市场上冬虫夏草混伪品现象严重, 常见混淆品如亚香棒虫草 ( C. barnesii) 、新疆虫草 ( C. grsacilis) 、北虫草 ( C. militaris) 等, 因此科学准确的进行冬虫夏草的真伪鉴别十分迫切而重要。近年来, 有关冬虫夏草极其混淆品的鉴别研究也有一些报道［2-7］, 但是鉴别方法多局限于传统的生药学鉴别, 在应用上具有一定的局限性。本实验在性状、显微鉴别的基础上, 进一步采用DNA分子鉴别技术, 在基因水平对冬虫夏草进行鉴别研究, 为冬虫夏草的鉴别提供新的科学依据。 1 ssr-pcr检测 野生冬虫夏草、亚香棒虫草、新疆虫草分别采集于我国西藏、青海、新疆等省区, 经香港科技大学中药研发中心董婷霞博士鉴定学名, 样品现存放于香港科技大学中药研发中心。 DNeasy Plant Mini Kit试剂盒 ( QIAGEN公司) ; WizardTMPCR Preps DNA Purification System ( Pro- mega公司) ; Taq DNA聚合酶 ( Progema公司) ; dNTP ( Progema公司) ; DNA Marker ( MBI Fermentas公司) 。Olympus光学显微镜 ( Olympus公司) ; PCR System 9700 ( PE公司) ; DU - 640核酸蛋白分析仪 ( BECKMAN公司) ; 蛋白核酸成像仪 ( Pharmacia Biotech公司) 。 2 方法 2.1 设计临时中发现的相关联点 在性状鉴别与药材数码成像拍摄的基础上, 采用石蜡制片法分别制作冬虫夏草子座可孕部位和虫体横切面永久制片, 采用粉末制片法制作冬虫夏草粉末临时制片, 光学显微镜下观察组织横切面特征与药材粉末特征, 数码成像系统拍摄主要显微鉴别特征。 2.2 rapd片段的纯化及纯化 2. 2. 1 DNA的提取、RAPD分析冬虫夏草及其混淆品的DNA提取、RAPD分析见文献报道的方法。 2. 2. 2特异性RAPD扩增片段 ( RAPD-SCAR) 克隆测序对冬虫夏草的特异性RAPD扩增片段进行胶回收纯化, 纯化片段与pGEM-T载体 ( Promega) 连接后转化至大肠杆菌DH5感受态细胞中, 筛选阳性克隆并进行序列分析。 2. 2. 3 SCAR-PCR标记鉴别引物的设计与鉴别条件的建立用Primer premier 5. 0软件从RAPD- SCAR序列的两端分别设计上下游引物。通过对鉴别PCR反应条件的优化, 建立PCR鉴别反映参数: ①94 ℃预变性5 min; ②94 ℃ 变性1 min; ③65 ℃ 复性30 s; ④72 ℃延伸45 s; ⑤重复② ~ ④步骤共27个循环; ⑥72 ℃ 保温3 min。 3 结果 3.1 子座与子囊壳特征 3. 1. 1性状鉴别冬虫夏草由虫体与从虫头部长出的真菌子座相连而成。虫体似蚕, 长3 ~ 5 cm, 直径3 ~ 8 mm; 表面深黄色至黄棕色, 有环纹20 ~ 30个, 近头部的环纹较细; 头部红棕色, 足8对, 中部4对较明显; 质脆, 易折断, 断面略平坦, 淡黄白色, 有时中间有一个近“V”形或不规则形状的灰黑色芯。子座细长圆柱形, 长4 ~ 7 cm, 直径2. 5 ~ 3. 5 mm; 表面深棕色至棕褐色, 有细纵皱纹, 上部稍膨大; 质柔韧, 断面类白色。气微腥, 味微苦 ( 图1) 。 3. 1. 2显微鉴别横切面特征: 子座可孕部位横切面: 近圆形, 内部充满了密集的菌丝。子囊壳呈卵圆形或椭圆形, 分布于子座表面, 子囊壳内有多数线形的子囊, 子囊壳间由密集的菌丝相连 ( 图2) 。 虫体横切面: 近圆形或不规则形, 中间有一个近 “V”形或不规则形状的芯。外侧为体壁, 内为大量的菌丝, 其间有裂隙。体表着生很多长短不一的刚毛 ( 图2) 。 粉末特征: 呈棕色, 虫体体壁碎片浅黄色或浅棕黄色, 密布瘤状突起; 刚毛极多, 长刺状或短刺状, 有的可见刚毛脱落以后留下的小凹窝。虫体碎片成片分布, 有的与棕色的体壁相连, 淡灰色, 细胞界限不明显, 内充满圆形的颗粒物。子座碎片成片分布, 有的与棕色的子座表皮相连