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心力衰竭大鼠下丘脑室旁核nadph亚基gp91phox表达与血流动力学的关系 心力衰竭（hf）是一种以身体神经系统功能障碍和异常血流动力学为主要特征的综合征。目前认为HF发生时交感神经系统首先被激活, 交感末梢释放去甲肾上腺素对心肌细胞有直接毒性作用, 并且引起肾素-血管紧张素-醛固酮系统 (RAAS) 、内皮素、心房钠尿肽等体液机制的激活, 进一步加重HF。因此对HF时交感神经兴奋机制的研究成为近来心血管疾病研究的热点。神经解剖学证实下丘脑室旁核神经元对外周交感神经活动有重要调节作用, 其中体液因素, 如:肾素血管紧张素系统、炎性细胞因子在HF时下丘脑室旁核增高, 并与外周交感兴奋有关。近来研究发现HF时下丘脑室旁核氧化应激反应水平明显增高, Kang等认为氧化应激水平可能与交感神经兴奋性之间的关系更加密切。因此本研究采用侧脑室给药的方法探讨下丘脑室旁核氧化应激反应对HF时交感神经活动的影响。 1 材料和方法 1.1 麻醉大鼠模型建立 成年健康雄性Sprage-Dawley鼠48只, 体重 (250±30) g, 购于山西医科大学实验动物中心。随机分为HF手术组 (HF组) 、假手术组 (SHAM组) 各为24只。饲养于室温 (23±2) ℃ 和光照控制12 h, 不限制饮食和饮水。用戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 腹腔注射麻醉, 气管插管, 连接动物呼吸机 (成都泰盟, HX-300) , 四肢皮下连接心电图电极进行心电监测 (成都泰盟BL-420生物信号记录系统) 。采用结扎左冠状动脉前降支方法诱导心力衰竭模型。假手术组只穿线不结扎。以术中II导联心电图出现ST段和/或T波抬高或降低, 心脏局部颜色变暗等心肌缺血变化作为结扎成功的标志。关胸时给予青霉素 (30 000 U) , 待大鼠苏醒后入笼饲养。次日再次麻醉大鼠, 固定于脑立体定位仪上, 剪开前囟周围皮肤, 暴露前囟以及周围头骨, 以前囟为中心, 向中线右侧0.13 cm, 向尾侧0.08 cm定位, 用钻头钻开头骨, 换0.7 cm长7号针头插入0.4 cm深即进入侧脑室, 外接微型渗透压泵, 泵内事先已灌入0.168 mL氧自由基清除剂4-羟基-2, 2, 6, 6-四甲基哌啶 (TEMPOL) , 泵埋入皮下后缝合皮肤。大鼠苏醒后饲养4周。 1.2 麻醉前准备工作 成年健康雄性SD鼠, 称重后戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 腹腔注射麻醉, 取右心室、肺脏。用右心室/BW、肺脏/BW来反映HF的严重程度。 1.3 成都市泰盟生物能效实验系统单次给药4h 被测大鼠术后4周时戊巴比妥钠 (50 mg/kg) 腹腔注射麻醉, 剪开颈部皮肤, 分离颈部肌肉, 暴露右侧颈总动脉, 插入直径约0.5 mm的硬塑管至主动脉, 硬塑管另一端接成都泰盟生物机能实验系统 (BL-420S) 记录平均动脉压 (MAP) 、左心室收缩压 (LVSP) 、左心室舒张末压 (LVEDP) 、左室压力最大上升、下降速率 (±dp/dtmax) 。然后腹侧面切开暴露肾脏, 剥离肾神经, 挂于银丝电极, 通过生物机能实验系统记录肾交感神经放电 (RSNA) 4 h。在一段相对控制的时间内, RSNA基础神经放电活动占最大神经放电活动百分比表示交感神经的兴奋性, 最大交感神经放电峰值通过注射硝普钠来引发。 1.4 组织切片观察 ①采用经心脏灌流法固定脑标本。大鼠行戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 腹腔注射麻醉后移入灌流室, 剪开胸腔, 暴露心脏, 从心尖部进针, 沿心腔入升主动脉, 400 mL生理盐水冲洗后, 改用4%多聚甲醛溶液500 mL缓慢灌流。灌流完成后迅速取脑并放入4%多聚甲醛溶液4 h, 取出, 再放入30%蔗糖溶液, 1 d至2 d后组织沉底, 即可切片。②免疫组织化学方法 (SABC三步法) :检测脑组织PVN区氧化应激反应水平。从蔗糖溶液中取出脑组织, OCT包埋, 使用冰冻切片机切片 (14 μm) , 切片后室温晾干。pH7.2～7.4磷酸盐缓冲液 (PBS) 冲洗3次, 每次3 min;Triton37 ℃孵育1 h, PBS冲洗3次, 每次3 min;滴加封闭液, 封闭20 min。滴加小鼠抗大鼠gp91单克隆抗体 (1∶100, 美国santa cruz公司) , 放置4 ℃冰箱内过夜。PBS冲洗3次, 每次3 min, 加入山羊抗小鼠Ⅱ抗 (武汉博士德公司) 孵育30 min;PBS冲洗3次, 每次3 min后, 再加入辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素37 ℃孵育30 min, PBS冲洗4次, 每次5 min后, 每张切片滴加2滴新配制的DAB显色剂, 室温下光镜观察其显色3 min～5 min, 显色满意后自来水冲洗5 min终止显色;之后常规梯度乙醇脱水、