新型仿生支架材料骨形态发生及对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化的影响.docxVIP

新型仿生支架材料骨形态发生及对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化的影响 0 生物活性玻璃 骨组织工程的核心内容包括支撑材料的构建、种子细胞的筛选、细胞与支撑材料之间的相互作用和机制。其中支架材料的构建是目前研究的热点,新型骨组织工程支架材料不仅仅以组织替代为目的,而且要能够促进组织再生,具有良好的生物活性特别是骨诱导性,因此如何研制出具有特定结构和骨诱导活性的仿生骨组织工程材料是亟待解决的关键问题之一。 目前骨组织工程常用的支架材料主要分为以下几类:(1)无机材料:包括羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃等,这类材料具有良好的生物相容性、骨传导性和较好的力学性能,但是这类材料在体内不能完全降解,质脆,易断裂。(2)有机高分子材料:主要包括聚乳酸、聚乙酸、聚乙酸-聚乳酸共聚物、聚酸酐和聚己内酯等,这类材料原料来源丰富、具有良好的可加工性、可塑性及可构建高孔隙率三维多孔支架等优点,其缺点是机械强度低,降解速率无法与新骨形成速率匹配,降解产物易引起无菌性炎症。(3)天然衍生材料:包括胶原、藻酸盐、纤维蛋白支架、煅烧骨、脱钙骨基质等,其优点是生物相容性好,具有天然多孔隙结构,缺点是一致性及可修饰性较差。上述材料各有优缺点,为了充分发挥各类材料的优势,弥补其不足,目前多采用联合材料制备复合支架的方法。本实验依据仿生原理,制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料,此材料是一种具有良好骨传导性的骨组织工程支架材料,为了进一步改善其骨诱导性,本实验根据骨形态发生蛋白7的序列特征、晶体结构和其与受体结合机制,设计合成含13个氨基酸的新型骨形态发生蛋白7多肽(peptide from bone morphogenetic protein 7,p BMP-7),将其与壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原材料复合,构建新型仿生支架材料p BMP-7/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原,并探索其对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、黏附及分化的影响。 1 bmscs的分离和培养 设计:单一样本观察实验。 时间及地点:于2010-08/11在中南大学卫生部肝胆肠外科中心实验室完成。 材料: 无菌条件下将pBMP-7用无菌去离子水溶解,使其质量浓度为2 g/L,然后将壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料制成5 mm×5 mm×2 mm立方形,将每个材料浸泡于0.5 mL多肽溶液中30 min,在负压下抽吸30 min,待pBMP-7溶液完全进入材料后,将其置于-20℃预冷1h后冻干,环氧乙烷消毒,-20℃保存。 pBMP-7的体外释放规律:取5份复合支架材料,每份负载pBMP-7 2 mg,分别浸入2 mL PBS中,充分混匀,置入37℃恒温箱中,在不同时间点提取释放液,采用高效液相色谱仪检测其中pBMP-7的含量,并计算累积释放量,高效液相色谱仪检测条件为流动相∶乙腈水为40∶60,固定相为Crest Pak C18S柱子(4.6 mm×150 mm),调节流速为1.0 mL/min,检测波长220 nm。 BMSCs分离培养及鉴定:参照Kadiyala等的方法进行BMSCs的分离培养,将SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,体积分数75%乙醇浸泡消毒20 min,无菌条件下取出双侧胫骨和股骨,剪除骨端,用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM低糖培养基冲洗骨髓腔,将冲洗液收集,用滴管缓慢滴加于Ficoll分离液上层,离心收集云雾状细胞层,PBS悬浮洗涤3次后,用含体积分数10%胎牛血清的DMEM低糖培养基吹打成均匀悬液后,以3×107L-1细胞数接种至50 mL培养瓶,置于37℃、体积分数5%CO2及饱和湿度孵育箱中,3 d后首次换液,以后每两三天换液,当细胞生长融合达70%~80%时,用0.25%的胰酶消化,以1∶3的比例传代培养。并进行CD90和CD34、表面标志物检测。 BMSCs与pBMP-7/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料的复合培养:取生长良好的第3代BMSCs,调整细胞浓度为1×108L-1,接种到置于24孔板的pBMP-7/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原材料上,每孔1 mL。常规培养72 h后将材料取出,PBS缓冲液漂洗3次后将材料用2.5%的戊二醛固定,体积分数30%~100%的梯度乙醇脱水,真空干燥,表面喷金处理后在扫描电镜下进行观察。 BMSCs黏附率的检测:在24孔培养板内置入复合p BMP-7的支架材料12片作为实验组,以12片未复合多肽的支架材料作为对照组。将细胞浓度为5×108L-1的细胞悬液0.1 mL滴加到两组材料上。置于培养箱中常规培养,于4,12 h后在实验组和对照组中各取出6片材料,PBS缓冲液冲洗3次,去除未黏附细胞。用0.25%的胰蛋白酶进行消化收集细胞并