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帕罗西汀对心理应激大鼠下丘脑cfos表达的影响 心理休克是许多精神疾病（如焦虑和抑郁）的重要原因。调查资料显示:焦虑或抑郁症的发生通常是反复心理应激的结果。帕罗西汀(paroxetine,商品名赛乐特,Seroxat)是治疗广泛焦虑症的选择性5-HT再摄取抑制剂(SSRI),虽然临床上帕罗西汀广泛用于各种应激相关障碍的治疗,但是它的作用机制的研究还只停留在神经递质与受体的水平,基因水平的药理机制尚不是十分清楚。本文采用免疫组织化学方法观察帕罗西汀对心理应激诱导的c-fos蛋白在大鼠下丘脑视旁核表达的影响,旨在探讨帕罗西汀减轻心理应激所致焦虑症状的中枢药理作用机制,为其合理应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 试剂及其配制 c-fos检测免疫组化试剂盒:购于北京中山生物技术有限公司;皮质醇放射免疫试剂盒:购于北京中山生物技术有限公司。盐酸帕罗西汀:白色粉末状可溶于水,批号:9901136,由上海葛兰素史克公司提供,溶于蒸馏水配制成所需浓度,ip体积为 1 ml·kg-1。大鼠行为测定仪:自制。 1.2 动物合格号 SD清洁级大鼠,雌性,7～8周龄,180～200 g,由温州医学院实验动物中心提供(动物合格证号:浙医字,将大鼠置于室温21～23 ℃、相对湿度45%、12 h 昼夜周期的动物室内。笼养,每笼4只,自由进食、饮水。32只大鼠随机分为4组,每组8只:正常对照组,束缚应激组,单次给药束缚应激组,连续6 d给药束缚应激组。 1.3 大鼠在限制期间表型 实验前,动物在实验室条件下适应至少1周。每天上午 8ue5fe00 将造模大鼠置于特制的限制器内,每日1次,每次 2 h,造模大鼠在限制期间禁食,禁水,连续 6 d后处死。正常对照组在同一时间也禁食,禁水。每天上午 8ue5fe00～9ue5fe00,正常对照组和束缚应激组大鼠腹腔注射等量的蒸馏水,连续6 d,单次给药束缚应激组大鼠连续腹腔注射等量的蒸馏水 5 d 后,d 6 腹腔注射盐酸帕罗西汀 1 ml·kg-1,连续 6 d 给药束缚组大鼠腹腔注射盐酸帕罗西汀 1 ml·kg-1,连续 6 d。 1.4 放射免疫法测定血浆皮质醇 腹主动脉取血,抗凝离心制备血浆,-20 ℃ 冻存,操作按照放射免疫试剂盒说明书要求进行。 1.5 脑胶质片内固定术 在10%水合氯醛(3 ml·kg-1)麻醉下,经左心室至升主动脉插管,先快灌流 0.9%氯化钠溶液100～150 ml,再慢灌注含 4 ℃ 的4%多聚甲醛(0.1 mol·L-1)磷酸缓冲液 100 ml。立即取脑固定于4%多聚甲醛中 24 h,再移至20%蔗糖磷酸缓冲液中过夜(4 ℃)至脑组织块沉底,次日连续冠状冰冻切片,切片厚 30 μm。取含下丘脑最大断面的切片(参照图谱the Fourth Edition of the Rat Brain in Stereotaxic Coordinates),收集于 0.01 mol·L-1的PBS缓冲液中。 1.6 抗兔igg抗体-hrp的显色观察 采用SP二步法:用多聚赖氨酸处理过的玻片捞片,置 60 ℃ 烤箱烤 30 min,以使切片紧密粘附,依次以下步骤操作:3%过氧化氢孵育 5 min,以阻断内源性过氧化酶;滴加兔来源的c-fos 1ue5fe100,30～50 μl,室温孵育 90 min;滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体,50 μl,室温孵育 20 min;应用DAB溶液显色(双蒸水 1 ml,A:50 μl,B:50 μl,避光保存,30 min 用完),在显微镜下观察;蒸馏水冲洗;苏木素复染;蒸馏水冲洗;脱水:70%酒精1次,75%酒精1次,95%酒精2次,无水酒精2次,2-甲苯2次,各 3 min;中性树胶封片。上述每步骤间均采用PBS充分洗涤。对照实验:取部分切片用 0.01 mol·L-1PBS 液代替兔来源的一抗进行孵育,其余步骤相同。 1.7 免疫阳性神经元记数 用HPLAS 1000高分辨彩色病理图文分析系统行Fos样免疫阳性神经元记数。所有切片均在同一光强度和同一放大倍数(×400)下分析。观察每只鼠含有室旁核神经元的所有切片,以最高密度切片为代表,测定每个视野内fos样免疫阳性细胞数。 1.8 c-fos阳性细胞密度的检测 应用SPSS 11.0 统计软件完成,用c-fos阳性细胞数占该切片观察细胞总数的百分率表示c-fos阳性细胞密度,数据以均数±标准差(ˉx±s)表示,进行方差分析,P0.05 为差异有显著性。 2 结果 2.1 单次给药对束缚应激大鼠血浆皮质醇含量的影响 各应激组大鼠血浆皮质醇含量明显高于正常对照组(P0.05),帕罗西汀单次、连续6 d给药可减少束缚应激大鼠血浆皮质醇含量,和束缚应激组比较有明显下降