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环境微生物群落的荧光原位杂交分析 在传统的微生物研究中，对自然环境中微生物的认识和了解主要基于传统的培养方法，如微电图法、活细菌数法（cfu法）和最大可能数法（pmn法）。但是通过研究,人们逐步认识到,自然环境中绝大多数(99%以上)的微生物种类是不能通过人工培养获得的,这就给微生物的分析和研究工作带来了极大的障碍。目前,微生物学和环境科学研究工作者们,都一直在寻找和探索一些新的分析方法来解决这些问题。随着近代分子生物学技术的发展,不依靠纯培养的微生物群落结构的分析方法已得到广泛发展和应用。 近年来,针对目前传统微生物分析方法存在的问题,在环境微生物领域,国际上诸多国家先后开展了分子生物学研究方法的建立和生物学评价工作,更精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性。目前在微生物生态学研究中常用的方法有:核酸探针杂交技术、DNA直接测序、rRNA序列同源性分析方法和梯度凝胶电泳方法等,使微生物生态学研究有了重大突破。1988年,Giovannoni将原位杂交技术引入了细菌学的研究中,他首先用放射性标记rRNA寡核苷酸探针显微探测细菌。随着安全性较强的荧光技术的发展,1989年,DeLong首先用荧光标记的寡核苷酸探针来探测独立的微生物细胞。此项技术即荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)技术,由于它安全、方便、实用,从而在环境微生物监测中得到广泛应用。通过在环境样品上直接原位杂交,不仅可测定不可培养微生物的形态特征及丰度,而且可原位分析它们的空间及数量分布。德国慕尼黑大学的Amann教授在环境微生物FISH技术研究中,进行了大量深入详尽的工作。Wagner、Manz及Luxmy,在此方面特别是在污水处理中对微生物的种群原位监测投入了大量的精力,对不同城市污水处理厂混合液样品的微生物种群进行荧光探针原位检测,发现beta-亚纲的变形细菌所占比例最高,其次是Cytophaga-flavobacterium菌群和高G+C含量的革兰氏阳性细菌,而gamma亚门的变形细菌所占比例较低,在10%以下。最近,随着这些研究工作的开展,一些分子生物学研究分析技术,其中特别是简便、实用的FISH技术,正在环境科学研究工作中逐渐被广泛应用。 本文将在简述FISH技术基本原理的基础上,对FISH技术在废水生物处理微生物生态学检测中的应用研究状况进行介绍。 1 fish技术介绍 1.1 检测16srrna的探针设备 细菌细胞内核糖体数量达104~105,核糖体RNA(rRNA)有特异区和高度保守区,对物种的进化有指示性作用,被称为微生物体内的“活化石”。核糖体内的16S-rRNA的序列是最理想的用于基因分类的靶序列。因为16S-rRNA分子结构上高度保守,只有某些位置有少量核苷酸序列的改变,而这些位置的改变具有种属特异性。另外,它信息较多,且长度适中,约1500 bp。所以根据16s rRNA序列的保守性和特异性可设计所需要的不同分类级别的寡核苷酸探针。所谓核酸探针是指,能识别特异核苷酸序列的带标记的一段单链DNA或RNA分子,只与被检测的特定核苷酸序列结合,不与其他系列结合。对微生物探测的FISH技术中使用的16(~23)S-rRNA寡核苷酸探针,一般是进行了荧光标记20 bp左右的特异性核苷酸片段上。利用该探针与固定的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交。分子杂交是DNA的变性和与带有互补的同源单链退火配对形成双链结构的过程。而上述过程并不需要DNA或RNA的提纯、扩增等繁琐步骤,实用性较强。 1.2 载玻片的制备 该技术主要操作步骤包括:(1)活性污泥的预处理:革兰氏阳性细菌用50%乙醇溶液,革兰氏阴性细菌用4%多聚甲醛处理;(2)样品在载玻片上固定并用乙醇脱水;(3)寡核苷酸探针杂交:一般在46℃下杂交1~3 h;(4)样品清洗:用48℃水浴的清洗液及冰浴的超纯水清洗;(5)封片观察。通常要结合使用一些通用的寡核苷酸探针对微生物样品进行区域界定及不同分类级别的区分。如EUB338探针是细菌的通用探针,DAPI染色可作背景来界定生物体细胞的区域。并结合其他特异性探针,选择不同颜色的荧光标记,同时,进行荧光原位杂交。 2 原位杂交技术 微生物是废水生物处理过程中的作用主体,通过新陈代谢过程,具有分解和矿化有机物的能力。处理系统中微生物的一般存在方式为活性污泥和生物膜。研究并阐述活性污泥及生物膜微生物生态系统的组成、结构与功能,对于进一步了解微生物种群之间的相互关系,以及微生物群落结构与处理效率的相关性及其工程调控,进一步提高微生物对有机污染物的降解能力,提高废水的生物处理效率具有重要的理论和实用意义。传统的培养法由于具有客观的局限性,不适合对污泥生态结构及物种组成进行全分析。FISH能够克服传统方法上