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我国转基因植物研究与开发现状 自1983年人类首次收到转移植物以来，植物互补技术在人类中迅速发展。转基因作物于1987年被允许进入田间鉴定试验,1992年开始大田产量试验,1995年完成安全性评价研究,1996年进行商业化生产,当年种植面积仅为174万hm2,到了2002年,这一数字增长了33倍。据农业生物技术应用国际服务组织(ISAAA)2008年报告,2007年全球23个国家共种植近1.143亿公顷转基因作物,约占全球农作物种植面积的12.7%。目前,产业化的转基因作物主要包括抗除草剂大豆、抗虫玉米、抗虫棉花和抗除草剂油菜等,其他具有高产、优质、抗病、抗逆、高效吸收营养等优良性状的转基因作物也呈现良好的产业化前景。同时,转基因植物检测技术也在不断丰富和创新。快速、准确、高效、简便的鉴定技术不但有利于转基因植物新品种培育,而且节省时间和成本。目前,转基因植物检测方法可以分为3类:第一类是在整合水平上进行的检测,包括PCR检测、Southern blot检测和染色体原位杂交检测等;第二类是在转录水平上进行的检测,包括RT-PCR检测、Northern blot杂交检测等;第三类是在表达水平上进行的检测,包括组织化学染色检测、荧光蛋白检测、Western blot检测、ELISA检测、叶片退绿检测和叶片涂抹除草剂检测等。 1 外源基因的综合水平检测 1.1 pcr检测基因片段的扩增 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是20世纪80年代中期由Mullis发展起来的体外核酸扩增技术,广泛用于外源基因检测、目的基因标记、功能基因分离和克隆等。该技术以极少量目标DNA为模板,加入目标基因特异性引物,在DNA聚合酶作用下,由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA片段得以迅速扩增。该技术可根据目的基因、标记基因序列设计PCR引物,从转基因植株中扩增外源基因片段,而非转基因植物基因组则不能扩增出相应的目标片段。 PCR技术创立以来在转基因植物检测中得到了广泛应用。如Ortiz等对转hpt基因和bar基因小麦分别进行了单引物对和双引物对PCR检测。叶兴国等对转入小麦中的npt II基因、bar基因、GCE基因,转入大豆中的bar基因、VIP1基因,转入水稻中的hyg基因,转入草坪草中的npt II基因等进行了PCR检测,尝试了在同一反应体系中对bar基因和VIP1基因同时进行PCR检测,鉴定出了无筛选标记转基因大豆植株。 1.2 外源基因序列 Southern blot是由Southern等1975年提出的DNA印迹转移技术,其原理是将限制性内切酶消化后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳,变性处理,然后在高盐缓冲液中通过毛细管作用将凝胶中的DNA片段转移到硝酸纤维素(NC)膜上,变性的单链DNA与膜结合,烘干后即固定在膜上,然后与放射性标记的探针杂交,检测与探针具有同源性的DNA片段。Sambrook等对Southern blot技术进行了改进,使该技术在转基因植物检测中得到了广泛应用,被认为是筛选阳性转基因植株最为可靠、稳定的方法,在目标基因附近选择一具有单切位点的内切酶对基因组DNA进行酶切,然后用标记的目的基因片段作为探针与消化的基因组DNA进行杂交,包含目标基因的基因组片段与探针具有同源性,可发生同源重组,从而显示出杂交信号,并可分析转基因植株中外源基因插入的拷贝数。 Ortiz等对利用基因枪介导法获得的转hpt基因和bar基因小麦进行了Southern blot检测,证明了外源基因在小麦基因组中的稳定整合和hpt作为筛选标记用于小麦转基因研究的可行性。Cheng等利用Southern blot技术对农杆菌介导法获得的小麦转基因植株进行了检测,证明了外源基因小麦基因组上的稳定整合,确认转化效率为0.1%~4.3%,外源基因整合拷贝数为1~6个,单拷贝整合植株占35%。Hu等利用Southern blot技术对农杆菌介导法和基因枪介导法获得的小麦转基因植株进行了分析,表明农杆菌介导法转化效率显著高于基因枪介导法,且转基因植株质量好、整合拷贝数少、可重复性高。Vladimir等对利用农杆菌介导法转化玉米成熟胚愈伤组织获得的转基因植株进行了Southern检测,转化效率为2%~11%,外源基因整合拷贝数为1~6个,约66%的植株含有1~2个拷贝。叶兴国等对转npt II基因、GCE基因、RIP基因、BCL基因小麦,转bar基因、VIP1基因大豆,转hyg基因水稻,转npt II基因、ots A基因芦荟等进行了Southern杂交分析,明确了外源基因整合拷贝数和在受体植物中的遗传规律。 1.3 染色体原位杂交分析 染色体原位杂交技术(chromosome in sit