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土壤微生物群落多样性解析技术研究进展 很丰富的微生物存在在土壤中。据估计，1克土壤中大约有1000万类型的微生物。以群落的形式存在于土壤中的微生物不仅是土壤养分和有机质循环和转化的动力,而且也影响着土壤的结构、土壤肥力以及地上植物的健康等。另外,土壤微生物也是一个相当大的地下能源宝库,世界的可持续发展以及未来能源问题的解决都离不开土壤微生物。因此,土壤微生物系统越来越成为当代最前沿的研究内容之一。土壤微生物研究中非常重要的研究内容之一就是土壤微生物群落多样性的研究。通过土壤微生物多样性的研究不仅可以预测土壤养分和环境质量的变化,而且还可以认识和掌握在土壤微生物生态中起重要作用的微生物类群和他们的功能角色。 土壤微生物群落多样性主要研究土壤环境中微生物种群的种类、丰度、分布均匀性、结构变化和微生物群落的功能多样性等。在过去的40多年里,土壤微生物多样性的研究方法已经从传统的培养分离发展到了无需培养的现代分子生物学技术。为了更好地了解和把握这些技术和方法,本文将简要地综述他们的原理,优缺点以及在土壤微生物多样性解析中的应用,并且展望这些技术的发展方向。 1 生物酶活性的检测 这部分主要包括以培养为主的平板计数和形态分析、以检测微生物酶活性的群落水平生理学指纹分析以及以微生物细胞内生化成分为分析指标的生物标记法。 1.1 计数、生理生化特性 在20个世纪70年代以前,土壤微生物多样性解析技术主要依靠细胞的培养分离和形态分析,即通过人工配制的简单营养基质对土壤中的微生物进行定时定温培养,然后对生长的菌落进行计数、并通过形态构造和生理生化特性来鉴定种属。该方法直观快捷,而且可以提供具有代谢活性、异养类型等种群信息。然而,微生物在实际土壤生境中的生长与温度、pH值、养分和种间的相互作用有很大关系,简单的人工模拟环境是无法满足其生长要求的。因此,这种方法仅能培养出极少数(少于1%)的微生物。Torsvik等利用染色法在荧光显微镜下观察到1 g(干重)土壤中含有4.2×1010个细菌细胞,而在培养平板上仅有4.2×106个细菌菌落形成(CFU)。 1.2 功能多样性和种群结构 这个技术主要是基于某一微生物群落所含有的酶可催化利用特定的碳源基质,然后通过测定其利用能力和模式来评价微生物种群多样性。Garlan和Mills于1991年首次提出该技术,经BIOLOG公司商业化后在土壤微生物群落功能多样性的评价研究中得到了广泛的应用。如,Derry等利用BIOLOG系统分别研究了杂酚油污染土壤和北极土壤中微生物的功能多样性和种群结构;李云等利用BIOLOG生态测试微平板研究了气候对旱地紫色土微生物功能多样性的长期影响,结果发现中亚热带气候的紫色土壤微生物对含C化合物的利用能力强,而暖温带气候的紫色土壤微生物对含N化合物的利用能力强。BIOLOG公司根据不同的检测目的开发了ECO(生态板)、GP(革兰氏阳性板)、GN(革兰氏阴性板)、FF(丝状真菌板)和MT等一系列微平板。每个平板上有96个微井,其中95个微井的干膜上都含有碳源基质和氧化还原染料,一个不含碳源的微井用作对照。当微生物利用碳源进行呼吸时释放出的NADH还原染料并使其变色,然后通过测定氧化还原燃料的变色速率来推测微生物的呼吸速率,最终达到评价能利用碳源基质的微生物种类和利用程度的目的。MT微平板上只含染料不含基质,允许科研人员自行设计和检测不同的碳源基质。 该方法具有自动化程度高,检测速度快等优点。然而,BIOLOG系统仅限于检测那些可培养、能迅速生长的微生物。检测结构并不能完全代表原位的代谢多样性。另外,样本处理、培养条件和微平板应用类型等都会给微生物多样性评价带来误差。 1.3 土壤微生物多样性分析 生物标记法主要是利用微生物细胞内某种生化成分的结构特点来区别微生物种类。这种方法避免了传统培养法的缺陷,能比较客观地评价微生物多样性。方法的主要步骤是通过提取土壤微生物中的某种生化成分并纯化,然后利用气、液相色谱等化学手段对该种化学成分进行分类鉴定。常用的微生物多样性生物标记法有:磷脂脂肪酸分析法和呼吸醌指纹法。 1.3.1 盐碱地微生物多样性 磷脂是所有生物活细胞重要的膜组分。在正常生理条件下,磷脂中的长链成分———PLFA在细胞内的含量一定而且具有生物特异性,故PLFA可用作微生物群落分析标记物。磷脂随着细胞的死亡而很快分解,PLFA总含量可以用来表征活性微生物的生物量。通过从土壤中提取PLFA并且测量其种类和丰度来判断特定微生物种群的存在和丰度,进而揭示土壤微生物种群结构和多样性的变化。Murata等分析了大米土壤中细菌群落多样性和PLFA的关系后发现,细菌多样性和PLFA的量呈比例关系。Keith-Roach等的研究表明,温暖的季节可促使盐碱地微生物的PLFA丰度增加,并且发现一