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中药赤芍中拮抗脂多糖的药理学活性检测 严重烧伤、伤口和感染可由外源性细菌感染或肠内毒素酶波动引起，脓毒症（pi）可能会加剧。脓毒症是临床危机患者死亡的主要原因，死亡率为56%-60%。目前已证实,革兰阴性菌内毒素(endotoxin),即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引起脓毒症的主要启动子。 赤芍为毛茛科芍药Paeonia Lactiflra Pall或川赤芍Paeonia Veitchii Lynch的干燥根。属传统的活血化瘀类中药,其味苦,微寒,归肝经。具有清热凉血,散瘀止痛之功能。现代药理研究表明其具有抗凝、抗血栓、抗氧化等广泛的生物活性,能够用于心血管、肝脏等多种疾病,最近的研究表明赤芍具有很强的抗LPS作用,我们在前期的研究中发现,赤芍含有很高的具有与LPS发生结合作用的物质并从中分离出6个具有拮抗LPS作用的组分,笔者就是对这6种赤芍有效组分进行体外拮抗LPS的实验研究,从药效学角度深入探讨其物质基础,进而阐明其作用机制、明确其临床适应证,将具有重要的学术及临床价值。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 细胞、mtt和tnf-elisa试验 LPS O111:B4(美国Sigma公司),LPS检测鲎试剂(广东湛江安度斯公司),DMEM细胞培养液(美国Hyclone公司),MTT溶液(美国Sigma公司),小鼠RAW264.7细胞(购自ATCC),小鼠TNF-α ELISA试剂盒(北京晶美公司)。 1.1.2 elisarap3-el模型 EDS-99 LPS定量测定系统(广东湛江安度斯公司),ELISA Reader酶标仪(瑞典Biochrom 公司),二氧化碳孵箱(美国Thermo公司),水平离心机(上海科学仪器厂),低温高速离心机(美国Beckman公司)。 1.2 方法 1.2.1 两组细菌lps表达水平 将前期分离提取得到的6个赤芍提取物组分与定量的LPS标准品等体积混合,配成终浓度为:赤芍各组分为50 mg/ml和LPS 1 EU/ml,PMB组为对照,剂量为50 mg/ml,放入水浴箱,37℃孵育20 min后,取100 ml混合后的样本加入到100 ml的鲎试剂,按照EDS-99细菌LPS测定系统(动态浊度法)操作方法进行,测定中和后的LPS值,结果以EU/ml报告,并计算中和率:LPS中和率=(总LPS实测值-中和后LPS实测值)/总LPS实测值。 1.2.2 小鼠细胞中lps表达的检测 将来自ATCC的冻存单核细胞株RAW264.7细胞复苏,置37℃ 5%CO2培养箱中培养2～3 d后分瓶传代,最后离心收集细胞,通过细胞计数得到0.5×106/ml的细胞后加入到96孔培养板中,每孔200 μl。实验中分两组,一组在培养的小鼠RAW264.7细胞中加入终浓度为80 mg/ml的赤芍各组分,并同时加入终浓度为100 ng/ml的LPS,并以已经明确抑制LPS的多粘菌素B(PMB,终浓度为80 mg/ml)为对照;另一组在培养的小鼠RAW264.7细胞中加入赤芍各组分后只加入等体积于LPS的PBS为空白对照组,在CO2培养箱中孵育4 h后取上清,用ELISA的检测试剂盒测定TNF-α的含量。 1.2.3 心肌病原代培养rpm 为了排除赤芍组分本身的原因造成细胞死亡而影响细胞因子的检出。选择最有活性的赤芍1组分来检测对细胞活力的影响,将培养3 h后的RAW264.7细胞,加入不同浓度的赤芍1组分:LPS组加入100 ng/ml的LPS),继续培养2 h。将培养板置离心机,1000 rpm离心5 min,使细胞全部贴壁,小心吸去上清,PBS轻轻洗涤,再次离心。每孔加入200 ml新鲜DMEM培养液,再加入20 ml MTT溶液(5 mg/ml),37℃继续培养4 h后,终止培养,1000 rpm离心10 min,小心吸去孔内培养液,每孔加入150 ml二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解,在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值。 1.3 统计分析方法 所有的计量资料均以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS(statistical package for the social science)统计软件包进行分析,两组比较采用t检验,多组之间比较采用方差分析。以P0.05为差异显著,P0.01为差异非常显著。 2 结果 2.1 体外低表面活性剂的凝集反应 对内毒素的中和作用是抗内毒素物质抑制内毒素生物学效应的主要方式。体外的LPS中和实验结果显示赤芍1～6组分均能够抑制LPS催化的鲎试剂凝集反应。其中赤芍第1、4、5、6组分效果十分明显。结果见表1。 2.2 抑制tnf-fsh的效果 首先根据标准品的测定结果绘制标准曲线,结果见图1。 根据标准曲线换算出