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大鼠坐骨神经慢性压迫模型的制作 慢性疼痛的治疗是生命周期的中心主题，与适当的动物模型相结合。常用的神经性疼痛动物模型包括中枢神经系统疼痛模型、周围神经损伤模型与病变致外周神经痛模型。作者建立了大鼠坐骨神经慢性压迫 (chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI) 疼痛模型, 通过检测模型大鼠左右足热痛阈以及脊髓背角NR2B蛋白的表达来判断模型成功及持续时间, 为慢性疼痛的研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 动物 成年雄性SD大鼠30只, 体质量260～320 g, 购自河南省实验动物中心。 1.2 神经染色及局部治疗 30只大鼠随机均分成CCI组与假手术组。CCI组大鼠参照Bennett等的方法制作动物模型。腹腔注射100 g/L水合氯醛 (3 mL/kg) 麻醉后, 暴露右侧坐骨神经, 在该神经主干部位用6.0尼龙非吸收外科缝线结扎4结, 结间间隔1～2 mm, 结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动反应为宜, 术后大鼠置于安静、温暖、避强光环境喂养。假手术组大鼠仅暴露右侧坐骨神经, 不结扎。 1.3 大鼠左皮热痛阈测定 2组各取10只, 术后第3天利用鼠爪热辐射刺激测痛仪 (7371 plantar test, Ugo Basile, Italy) 测定大鼠左右爪底部的热刺激缩足反射潜伏期, 即热痛阈, 隔天测1次, 测至第6周末。 1.4 缓冲带测定nr2b阳性对照 结扎3周后, 2组剩余5只大鼠脊髓取材做切片, 滴加一抗 (兔抗人、鼠NRIB多克隆抗体, 工作浓度1:50; 购自武汉博士德生物工程有限公司) , 4 ℃过夜, PBS冲洗3次。滴加生物素化羊抗兔二抗, 37 ℃孵育30 min, PBS冲洗3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素 (SP) 工作液, 37 ℃孵育30 min, PBS冲洗3次。DAB显色, 镜下观察。以PBS代替一抗作为阴性对照。NR2B阳性为胞质内出现棕色颗粒。应用上海山富科学仪器有限公司Biosens Digital Imaging System图像分析软件分析阳性区积分光密度值。 1.5 组患者点左右成分配比及出血量的比较 采用SPSS 13.0对2组术后不同时间点左右爪热痛阈差值的比较行重复测量数据的方差分析, 对2组术后3周NR2B蛋白的表达水平行配对t检验, 检验水准α=0.05。 2 结果 2.12 假手术组f时间 CCI术后第7天结扎侧出现热痛觉过敏 (热痛阈下降) , 持续到第33天, 第35天后逐渐消失。CCI假手术组未见热痛觉过敏出现。 术前至术后41天, CCI组左右足热痛阈的差值分别为0.24±0.11、2.48±1.16、5.28±0.65、 5.78±0.67、4.77±1.01、4.57±0.78、5.13±0.89、4.77±1.01、5.11±1.01、5.01±1.01、5.48±1.16、6.54±1.01、5.48±1.16、6.28±0.65、4.78±0.67、4.77±1.01、2.75±1.08、1.53±0.49、1.12±0.31和0.41±0.11, 以上各时间点假手术组左右足热痛阈的差值分别为0.23±0.09、1.12±0.82、0.56±0.16、0.21±0.08、0.98±0.34、0.12±1.01、0.78±0.32、0.55±0.16、0.78±0.67、0.78±0.67、0.12±0.82、0.23±0.01、0.12±0.02、0.56±0.16、0.21±0.08、0.98±0.34、0.12±0.01、0.78±0.12、0.55±0.16和0.78±0.17。2组相比,F时间=13.724,P=0.001;F组间=237.012,P0.001;F交互=14.996,P0.001。 2.22 各组nr2b蛋白的积分光密度 见图1。光镜下可见NR2B免疫阳性细胞主要集中在脊髓背角。CCI组 NR2B蛋白的积分光密度为 (26 224.32±2 182.00) , 高于CCI假手术组的 (16 572.52±2 013.67) (t=8.652,P=0.005) 。 3 模型制作及分组 目前在疼痛实验研究中常用的神经病理性疼痛模型主要是在动物感觉传导通路上制造损伤。Bennett等创建了CCI模型, 该模型采用4.0铬制肠线对坐骨神经松结扎, 共结扎4道, 每道间隔1～2 mm, 受累神经4～5 mm。该模型模拟临床上慢性不完全性神经损伤, 是目前最为常用的神经病理性疼痛模型之一。但肠线结扎所致神经功能障碍不仅由于肠线遇水膨胀压迫神经, 肠线分解后化学刺激所致的神经炎症也起作用。作者在模型制作中采用6.0丝线代替肠线结扎, 动物术后结扎侧迅速出现异常疼痛的表现,