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植物病毒去除技术研究 植物病毒广泛分布，破坏严重，对世界花卉产业的发展产生了重大影响。近年来,随着我国从国外引种花卉的种植面积的扩大以及不规范的繁殖技术,病毒病开始流行,严重影响了中国花卉产业的发展。目前国内外多用组织培养脱毒方法来阻止病毒病的继续传播以便提高植物的产量和质量。因此,本文对当前植物组织培养脱病毒方法作了综述,以期从中得到启示,进一步促进植物脱毒方法及应用的相关研究。 植物组织培养脱毒方法有茎尖培养脱毒、热处理脱毒、冷处理脱毒、化学药剂处理脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒等,其中由于茎尖培养脱毒效果好,是目前植物无病毒苗培育应用最广泛、最重要的一个途径。研究表明,如果将不同的方法结合起来应用效果会更好,通常将茎尖结合热处理来脱毒。 1 茎尖生长点病毒途径 茎尖培养脱毒原理:在染病毒植株体内,病毒分布并不均匀,在生长点病毒含量最低。病毒通过维管束和胞间连丝传播,在分生区内无维管束,病毒扩散慢, 加之植物细胞不断分裂增生,所以病毒含量少,在茎尖生长点几乎检测不出病毒,因此切取茎尖愈小愈好,但实际操作中茎尖取太小不易培养成活,过大又不能去毒。 1.1 茎尖的切除、接种 将消毒后的材料放置在20~40倍解剖显微镜下,用解剖刀剥取0.1~1 mm的茎尖,迅速放入培养基中,如果在空气中暴露时间过长,就会因失水引起茎尖死亡。赵军良等人的研究表明,带有一个叶原基的茎尖,脱毒效果最好,成活率最高。不同的植物材料茎尖剥取的方法和最适合脱毒的茎尖大小不同。在菊花的茎尖培养中,在超净工作台内将消毒后的茎尖中用肉眼能看到的叶柄切除,在实体解剖镜下用解剖刀剥离顶芽至露出带有1~2片叶原基的生长点,生长点大小约在0.3~0.5 mm左右,大于以上尺寸脱毒率将会下降,反之成活率将会下降,迅速将摘出的生长点置于培养基中。就香石竹而言,切掉叶柄后,生长点是在几重叶原基的包围下,要从外到内逐一切掉外层叶原基,当生长点露出时把包括1~2片叶原基在内的生长点切下,迅速移入事先预备好的培养基内,注意生长点的方向及不要把生长点埋在培养基内。在康乃馨的茎尖培养中取带有1~2个叶原基、长0.2~0.3 mm的茎尖接种到培养基上,接种时只须沾取茎尖置于轻轻划破的培养基表面即可。洋葱可用0.5~0.7 mm茎尖培养,能有效地脱除洋葱中的O YDV 和GLV病毒。在对白葱的茎尖脱毒研究表明,以带有1片叶原基大小为0.2~0.6 mm的茎尖外植体较为适宜。 1.2 活性炭外植体 茎尖培养可能出现褐化、玻璃化等现象,这会严重影响植物的成活率,所以必须解决这些问题。褐化是由于外植体在培养过程中分泌的酚、醌类物质妨碍自身的生长,而活性炭可以吸附外植体在培养过程中的有害物质,从而达到防止褐化的目的。在香蕉茎尖培养的培养基中加入活性炭或与维生素C配合使用均能改善外植体褐变情况。玻璃化是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变,很难继续用作继代培养和扩繁材料,生根困难,移栽后也很难成活。实验表明,采用强光10 000~20 000 lx,在培养中提高糖和琼脂的浓度,降低细胞分裂素的用量,对克服香石竹茎尖培养玻璃化有明显效果。 2 热处理对茎尖的处理 热处理的原理是病毒由蛋白质组成,高温可以使蛋白质变性,所以通过高温钝化病毒。热处理的材料可以是母株(已长芽的块茎) ,也可以是已经剥离的已长到1 cm 左右的小植株。高温热处理是在恒温箱内进行,将籽球或小苗放入恒温箱中,起点温度可稍低些,逐渐升至处理温度,一般在35~54℃条件下热处理几小时、几天甚至几个月。 热处理通常与茎尖培养相结合脱毒,对于单用茎尖或热疗法难以脱除的病毒,可先进行热力处理,使植株茎尖无毒化,再采用茎尖组织培养法,这样可以提高脱毒成功的几率。赵祝成等人用水仙0.2~0.3 mm微茎尖培养、37±1℃热力处理30 d,可以有效脱除水仙病毒。香石竹置于38℃环境中60 d,其茎尖中的病毒即可被消除。在热处理茎尖的过程中,通常温度越高、时间越长、脱毒效果就越好,但是同时植物的生存率却呈下降趋势,所以温度选择应当考虑脱毒效果和植物耐性2个方面。洪霓等在梨病毒的脱毒研究中采用2种处理,一为恒温处理,温度控制在37±1℃;二为变温处理,温度为32℃和38℃每隔8 h变换1次,发现变温处理比恒温处理植株死亡率低,脱毒效率高。 热处理的缺陷是不能脱除所有病毒。例如在侵染马铃薯的病毒之中,对于PLRV、PVA和PVY不进行高温预处理,脱毒率也相当高,而高温预处理却可以显著提高对PAMV、PVX 和PVS的去除。一般而言,对于球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效,对杆状和线状病毒的作用不大。 3 植物激素对含病毒dna植株的分离和培养 其原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒