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棉花规模化转基因技术研究进展 1 棉棉转向技术研究与应用 棉花是世界上最重要的纤维木材和重要的油材料之一。常规遗传育种方法和手段虽然在提高棉花产量和抗性方面取得了长足的发展, 培育成了一系列的优良品种, 但在解决棉花棉铃虫、黄萎病、提高纤维品质等问题上遇到了巨大的挑战。棉花是目前少有的几种已投入商品化生产的转基因农作物之一, 自1996年转Bt基因抗虫棉投入商品化后, 转抗除草剂基因棉、抗逆棉也相继进入生产试验阶段, 同时棉花基因工程在抗病、抗旱、耐盐等方面的研究也初见端倪, 近年来转基因技术的应用, 使棉花的基础与应用研究日新月异 (表1) 。在棉花转基因研究与应用的初期, 主要以建立转基因体系为主, 目的基因为标记基因和不同类型的Bt基因, 受体材料主要是美棉coker201或coker312, 该材料转化率较高, 但在中国其农艺性状不佳。国内则首先以抗虫基因等为目的基因, 以生产中应用的棉花新品种为受体开始建立体系并获得大量转基因材料。花粉管通道法在棉花转基因初期曾大量应用, 随着农杆菌介导法的逐步成熟, 该方法的应用比重逐步加大。部分新方法如祝水金等的茎尖农杆菌转化法也开始取得成功。近年来, RNAi等在棉花中也取得较大进展, 更多研究者将功能基因导入棉花[20,21,22,23,24,25], 建立转基因体系, 获得新基因的功能。在国内, 转基因抗虫棉已大量种植。 棉花的转基因技术的基础是组织培养, 而棉属的组织培养在作物中是最难的一个。从1971年Beasley首次报道从陆地棉的胚珠诱导出愈伤组织, 直到1986年, Shoemaker等才报道了陆地棉珂字棉312和珂字棉201的再生植株。经过近20年的发展, 国内外研究已经获得了戴维逊氏棉 (Gossypium davidsonii Kellogg) 、雷蒙德氏棉 (Gossypium raimondii Ulbrich) 、瑟伯氏棉 (Gossypium thurberi Todaro) 、拟似棉 (Gossypium gossypioides Ulbrich) 、草棉 (Gossypium herbaceum L.) 、亚洲棉 (Gossypium arboreum L.) 、海岛棉 (Gossypium barbadense L.) 和陆地棉 (Gossypium hirsutum L.) 等棉种的再生植株, 并建立起了体细胞培养、花药培养、茎尖培养、胚珠和胚培养以及原生质体培养等不同的培养体系。很多实验室通过胚胎发生途径获得了棉花 (主要是陆地棉) 再生植株, 并建立一些棉花组织培养的体系。 1.1 由外植体转化为优势的基因资金转化技术 目前, 在棉花中用于遗传转化的方法主要有农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道法3种。 农杆菌介导法:农杆菌介导转化法可以高效地将外源基因整合到棉花基因组中, 外源基因可以稳定遗传和高效表达, 它必须以组织培养为基础。自1987年, Umbeck等和Firoozabady等先后报道了农杆菌介导的棉花遗传转化得到转化植株以来, 国内外研究者先后建立了以珂字棉等品种为受体的再生体系, 并取得巨大进展[6,34,35,36,37,38,39,40], 为棉花重要基因的功能验证和利用等工作提供了良好的技术平台。在机理研究方面, 棉花体细胞胚发生过程中体细胞胚起源、形态建成和胚胎学发育等相关的研究报告较多。此外, 棉花体细胞胚发生和再生过程中常伴随着大量的畸形胚和畸形苗, 与此相关的研究也有报道。在棉花的组织培养性状等方面已进行了诸多研究:不同类型外植体的体细胞胚能力差别很大, 即使在同一品种棉花不同外植体的体细胞胚发生能力也存在很大的差异。体细胞胚发生能力以下胚轴最容易, 子叶较差, 真叶和茎最差。目前, 陆地棉的组织培养主要以下胚轴为外植体, 通过脱分化和再分化得到再生植株。张朝军等发现中棉所24号的叶柄也具有较强的分化能力, 并在基础上建立了以叶柄为外植体转化体系。 基因枪轰击法:基因枪轰击法是继农杆菌介导法之后在棉花转化中应用最广泛的一项技术。该方法具有受体类型广泛 (茎尖、下胚轴、胚性细胞悬浮系等均可以作为转化的受体) 、受体无基因型限制 (很多的棉花品种已经通过该方法得到了转基因植株, 部分的品种已经商业应用) 等优点。1987年, 美国Cornell大学的Klein等首次以洋葱表皮细胞为材料, 以钨粉为子弹, 把DNA、RNA导入细胞, 且观察到外源基因能表达, 证明了基因枪轰击转化方法的可行性。1990年, 美国俄亥俄州立大学的John等第一次将此技术应用于棉花遗传转化中。目前报道的棉花基因枪转化效率只有4%左右, 有很大的提升潜力。影响基因枪转化效率的因素很多, 主要分为物理因素、生物因素和培养程序等。基因枪法多