CRISPR介导功能性核酸-蛋白的食品检测研究进展.docxVIP

? ? CRISPR介导功能性核酸/蛋白的食品检测研究进展 ? ? 孙 杨,李 佳,朱丽英,江 凌 (1.南京工业大学 食品与轻工学院,江苏 南京 211800;2.南京工业大学 化学与分子工程学院,江苏 南京 211800) 食品供应的全球化加剧了食品安全控制和可追溯性等研究的难度,每年约6亿人因为食品污染问题而患病,并导致其中约42万人死亡,从而引起人们的关注,并成为世界性问题[1]。美国营养标签和教育法案、欧盟国家的新欧洲法规以及“蒙特利尔议定书”对食品实验室提出了一定要求[2]。现行的《中华人民共和国食品安全法》对于食品中的添加剂、食源性致病菌、农兽药残留、重金属和生物毒素等有明确和严格的规定。为了应对这些挑战,这就要求科研人员开发出高效的检测手段来检测食源性致病菌,才能保障食品安全。 2020年诺贝尔化学奖颁给了对成簇间隔的短回文重复序列(CRISPR)做出创新性研究的Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna,从而使人们再次对她们所发现的CRISPR/Cas系统产生了浓厚兴趣并引起更多的关注。CRISPR及其相关Cas蛋白构成了古细菌和细菌中抵御外源核酸物质入侵的适应性免疫系统,该系统可以降解外源入侵的核酸[3-4],随后被开发为基因编辑工具。然而,随着Cas12a和Cas13a的反式切割活性被发现,基于Cas13a的SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)和基于Cas12a的DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPRtransreporter)相继被开发为核酸检测平台,并成为分子诊断领域的热点[5-6]。但是上述平台在检测非核酸物质方面的缺陷限制了其更广阔的应用。 作为一门新兴学科,合成生物学在应对这种缺陷时表现出具有巨大的潜力。合成生物学家通过“设计—搭建—测试—学习”,开发了种类繁多的生物元件,构建了更加精密且智能的基因电路。核糖开关、转录因子、适配体等功能性核酸/蛋白作为元器件,结合CRISPR核酸检测技术,在离子、氨基酸、辅酶、食源性致病菌、毒素和农兽药残留等方面的检测应用,为分子诊断学带来了新的机遇。 笔者概述了CRISPR系统的分类及其代表蛋白的作用机制,如何利用不同的Cas蛋白的特性进行检测分析,列举了不同的元器件及其应用。笔者也分析了不同元器件和CRISPR系统的组合,并概述了该技术在食品检测中的应用,同时展望了合成生物学和CRISPR检测技术在食品检测中的应用前景和未来研究方向。 1 CRISPR的概述 1987年,日本科学家首先在大肠杆菌中发现CRISPR,经过多年的研究发现,CRISPR系统是多数细菌和古细菌的一种适应性免疫防御系统,通过适应、表达和干扰3个阶段介导的免疫机制,用于抵制外源核酸及噬菌体的入侵[3-4]。该系统主要由DNA靶向间隔序列、非重复间隔序列和Cas效应蛋白组成。 1.1 CRISPR系统的分类 根据Cas效应蛋白可将CRISPR系统分为2大类,包含6小类、33个亚型(图1)。 第一类CRISPR-Cas系统中的Cas蛋白具有多亚基效应器复合物,介导CRISPR RNA前体(pre-crRNA)加工和结合以及通过裂解进行干扰,主要有Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型蛋白,分别包括Cas3、Cas10和Csf1[7-9]。研究表明,大约90%的CRISPR-Cas系统属于第一类,广泛存在于真菌中,少数存在于细菌中[10]。Ⅰ型系统由多个效应蛋白协同作用:Cas6或Cas5介导CRISPR RNA(crRNA)解旋并与靶DNA结合,Cas7稳定R环,然后Cas3切割靶DNA[8,11]。Ⅲ型系统由Csm复合物(Ⅲ-A系统)、Cmr复合物(Ⅲ-B系统)和crRNA组成。该系统的Cas10可以产生环状寡核苷酸-(A)核苷酸,激活Csm6的RNA酶活性,切割靶RNA[12-13]。Ⅳ型系统由于存在于质粒中,暂时还不了解其作用机制[14],但是有研究表明Ⅳ型系统可能促进细胞内和质粒间的竞争,在调节质粒之间的冲突方面发挥了作用,并且与Ⅰ型CRISPR-Cas系统之间存在串扰[15-16]。此外,有报道显示Ⅳ-B型CRISPR核糖体核蛋白复合物由1个类Cas7丝和1个小亚单位(Cas11)丝缠绕而成,但该复合体缺乏RNA加工和靶DNA切割的亚基[17]。 图1 CRISPR系统的分类Fig.1 Classification of the CRISPR system 第二类CRISPR-Cas系统中的Cas蛋白具有单个蛋白的效应器复合物,主要有Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型蛋白,主要存在于细菌中,由于其简单高效的特点,已经被研究人员开发应用于基因编辑和核