CORRECT介导的人HBB-28基因定点突变细胞株的建立及其应用.docxVIP

? ? CORRECT介导的人HBB-28基因定点突变细胞株的建立及其应用* ? ? 刘永祥，麦庆云，黎允诗，梅珺琰，梁爱军，彭新良，周瑞鸿，周少虎** (1.广州中医药大学第一附属医院生殖医学科，广东广州 510405；2.中山大学附属第一医院生殖医学中心，广东广州 510080；3.广州医药研究总院有限公司，广东广州 510220) β-地中海贫血(简称β-地贫)是由人β-珠蛋白(HBB)基因突变引起的，是我国南方发病率最高的单基因遗传病[1]。其中，HBB-28(AG)突变是我国β-地贫患者携带的5种最常见的HBB突变之一[2]。与其他亚型不同，HBB-28(AG)突变位于起始密码子上游28个碱基的启动子区内，突变的产生破坏了转录因子ATA box的结合，降低了HBB的RNA表达[3]。纯合子或复合杂合子-28(AG)突变的患者可出现重度贫血或中间型贫血[4]，然而，由于纯合子患者临床材料有限，并且其基因突变位于非编码区，目前非编码区突变影响相关基因转录组表达水平的研究较少。 近年来，由于操作简单、成本低和效率高等优点，规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)技术被广泛应用于各种生物体的基因组编辑[5]。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在特定位点制造特定的DNA双链断裂(DNA Double Strand Breaks,DSBs)和同源定向修复(Homology Directed Repair,HDR)以引入或纠正特定的基因突变已经成为首选的方法[6]。本研究在CRISPR/Cas9技术的基础上，通过沉默突变阻断连续的再次靶向或再次切割的CRISPR/Cas靶点(Consecutive re-Guide or re-Cas steps to Erase CRISPR/Cas-blocked Targets，CORRECT)的新型无痕基因组编辑技术[7]，在人HBB基因上引入HBB-28(AG)点突变，高效建立人β-地贫HBB-28(AG)HEK293T纯合突变细胞株，为后续疾病的细胞和分子基础研究，以及建立基因突变修复方法奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株和质粒 HEK293T细胞由本实验室保存，CRISPR/Cas9质粒PX459购自美国Addgene公司，pCMV-GFP-p62购自上海碧云天生物技术有限公司。 1.1.2 主要试剂和仪器 限制性核酸内切酶BbsⅠ、T7EⅠ、AatⅡ、T4连接酶、T4磷酸化酶均购于美国NEB公司，小向导RNA (small guide RNA，sgRNA)以及PCR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，单链寡核苷酸(single-stranded Oligo DNA Nucleotides,ssODNs)由苏州金唯智生物科技有限公司合成，Trans 5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，X-tremeGENE HP DNA细胞转染试剂盒购于上海罗氏制药有限公司。荧光倒置显微镜为德国徕卡(Leica)仪器有限公司产品，PCR基因扩增仪为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。 1.2 方法 1.2.1 sgRNA的设计与CRISPR/Cas9表达质粒构建 查询人HBB基因序列(Genbank:NC_000011.10;/)，利用网站设计sgRNA靶点。根据确定的sgRNA靶点序列合成2对互补引物，sgRNA均为正义链序列靶点，因此，需在引物5′端加上BbsⅠ酶的黏性末端，其中，CACC加在正向引物前，AAAC加在反向引物前(表1)。sgRNA引物磷酸化与退火：分别取1 μL T4磷酸化酶、1 μL正向引物和1 μL 反向引物(浓度均为100 μmol)，混匀后进行5′端磷酸化修饰，并经退火形成双链(37℃，30 min；95℃，10 min)。双链sgRNA与线性化CRISPR/Cas9质粒连接：分别取1 μL T4连接酶、2 μL退火产物，以及100 ng经BbsⅠ酶处理的线性化二合一CRISPR/Cas9质粒，混匀后于16℃连接过夜，获得PX459-sgRNA1-Cas9和PX459-sgRNA2-Cas9的共表达质粒。转化(热激法)：按照Trans 5α感受态细胞的产品说明书，将10 μL连接产物转化入100 μL感受态细胞中，轻轻摇匀，冰上放置30 min，42℃水浴中热激45 s，迅速置于冰上冷却2 min，涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体平板，37℃倒置培养16-18 h。测序验证：分别挑取8个单克隆菌落至LB液体培养基中，37℃、220