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工业微生物育种技术的研究进展 1 菌株富集法spe和传统富集法即梯度法 传统育种是根据自然突变为基础选择优良菌株的繁殖方法。一般来说，由于dna的半保留和复制、修正酶系的光恢复、光恢复、切除和修复以及特定修复的作用，自然突变的可能性非常低，通常为10-610-10/bp。此外，用于工业生产的菌株的特性通常由单个或多个基因控制。因此，传统的繁殖时间长，工作量大。在这种情况下，我们发现了一系列致动器基因，尤其是dn、mutd、mutt、dam、muts、muth、muti、muts等。含有这些增变基因的细菌的突变相对较高，富集法筛选技术的不断完善和改进极大地提高了传统育种的效率，但比其他育种方法更低。 2 化学诱变剂 1927年MILLER发现X-射线能诱发果蝇基因突变.之后人们发现其他一些因素也能诱导基因突变,并逐渐弄清了一些诱变因素的机理,为工业微生物诱变育种提供了前提条件.根据育种需要,有目的地使用诱变因素,可使菌株的基因发生突变以改良其生产性状. 目前,人们用于诱变育种的诱变因素有物理因素和化学因素,前者包括激光、X-射线、γ-射线快中子等.后者主要是烷化剂(包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、MNNG、NTG等),天然碱基类似物,亚硝酸和氯化锂.在物理诱变因素中,紫外线比较有效、适用、安全,其他几种射线都是电离性质的,具有穿透力,使用时有一定的危险性.化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高,并且十分经济,但这些物质大多是致癌剂,使用时必须十分谨慎.目前,多种诱变剂的诱变效果、作用时间、方法都已基本确定,人们可以有目的、有选择地使用各种诱变剂 ,以达到预期的育种效果. 诱变育种取得了显著的效果,如青霉素生产菌的产量在40年内就增加了300多倍,达到6 000~8 900 ?u·mL-1; 谷氨酸的生产菌株经紫外线诱变处理,发生了多方面的变异,产酸率提高了31%,菌体形态从典型的八字形变的长短不一,用电镜超薄切片观察其亚显微结构,发现细胞厚度及透光度发生变化;用亚硝酸钠、紫外线等物化方法诱变产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌,使其从原来的以玉米粉为碳源转变为以大米为碳源进行发酵产酶,后用紫外线辐射进行诱变,最终筛选出F-8014菌株,产酶量提高了37%.目前,人们致力于探索获得新的优良突变种的有效途径,如研究新的诱变剂,比较各种诱变剂混合使用的影响与效果,寻找高效的筛选方法等.离子束诱变育种始于1996年,是根据氨基酸及核酸的生物合成途径,以生化和遗传学原理设计的筛选方法,如营养缺陷、抗代谢类似物、条件致死、膜透性改变等应用于基因突变后的筛选,提高了育种效率,该法被认为是获得优良突变株的有效途径. 3 原生质体融合技术 基因重组是遗传的基本现象之一,菌株经过基因重组获得新的遗传型,从而获得具有优良性状的菌种.基因重组是杂交育种的理论基础,由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本,所以不论是方向性还是自觉性,均比诱变育种前进了一大步.此外,杂交育种往往可以消除某一菌株在诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象,因而是一种重要的育种手段.但杂交育种方法较复杂,许多工业微生物有性世代不十分清楚,故没有像诱变育种那样得到普遍推广和使用.在工业微生物育种中,应用转化、转导或接合等重组技术来培育应用于生产实践中的高产菌株的例子还不多见,只是在1978年第二届国际工业微生物遗传学讨论会上提出了原生质体触合后,重组育种技术才获得了飞速的发展. 原生质体融合技术起源于20世纪60年代,1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象,同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合,从而开始了细胞融合的探索.1974年匈牙利的Fereczy采用离心力诱导的方法实现了白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株原生质体的融合; 随后人们相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合,但融合率比较低; 同年Kao发现PEG在适量Ca2+存在下能有效的诱导植物的原生体融合;1978年国际工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体的融合问题,使这一技术迅速扩展到了育种领域;1979年匈牙利的Pesti首先提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量,从而开创了原生质体融合技术在工业微生物育种实际工作中的应用. 原生质体融合技术不受亲缘关系的影响,能进行原生质体融合的细胞极其广泛,不仅包括原核生物中的细菌和放线菌,还包括各种真核生物的细胞,遗传信息量大,不需了解双亲详细的遗传途径,便于操作.原生质体融合技术日益受到国内外生物学者的重视,对这种技术的研究较多,成绩显著.融合方法也得到了进一步发展,如1980年Zimmermann等报道了电场诱导细胞融合技术,提高了融合频率;林炜铁等