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工业微生物育种研究进展 工业微生物作为应用微生物的一部分，具有高度的应用价值。当代生物技术特别是发酵工程技术的最终产品一般都是经过工业微生物生产得到的,已取得了举世瞩目的经济效益和社会效益。20世纪70年代以来,重组DNA技术和原生质体融合技术开始用于菌种选育。各种外源基因在原核生物、真核细胞的克隆和表达研究取得了重大成就。使工业微生物育种技术进入了真正意义的分子水平育种时代。 微生物发酵要想取得优良成绩,有赖于优良菌种的利用。从工业发酵的观点来看发酵菌种的优异生产性能等于经选育的、符合经济要求的优良遗传背景加上经人为精心设计的、优化的发酵环境。菌种选育的最终目标,就是通过人工干预,使选出的优良菌种在优化环境中尽可能表现出优异性状。菌种分离、筛选、改良是贯彻微生物发酵始终的工作。 1 为细菌育种的具体目标 (1) 提高产量 (2) 提高样品的纯度 (3) 改变这种疾病的性质 (4) 疫苗的遗传特性 (5) 改变生物合成的路径 2 菌株的改良方法 广义上说,菌种改良可描述为采用任何科学技术手段(物理、化学、生物学、工程学方法以及它们的各种组合)处理微生物菌种,从中分离得到能显示所要求表型的变异菌种。 菌种改良的基本途径:突变和选择;基因重组(遗传重组)和基因工程(遗传工程)。 2.1 诱变剂的使用应根据微生物的生产 传统的诱变及筛选是最常用的菌种改良手段。关键的第一步是用物理化学或生物的诱变因子修改目的微生物的基因组(genome),产生突变型。微生物的自发突变频率在10-5~10-8之间,经诱变剂处理微生物细胞后,可大幅度提高突变频率,达到10-3~10-6,这比自发突变提高了上百倍。 诱变剂的作用是扩大基因突变的频率,因此应选择高效诱变剂如NTG、60 Coγ-射线、UV等;考虑诱变剂的种类、剂量、处理时间等诱变条件;诱变剂对DNA损害的类型和损害的程度;2种以上诱变剂的复合处理;诱变后的处理条件;被处理微生物的生理状况:处理的是营养体细胞、休眠体芽孢、分生孢子还是除去细胞壁的原生质体;细胞是单核还是多核;菌种对诱变剂的敏感性和同一种诱变剂处理同一菌种的次数(频率)以及每次诱变处理后菌种产量提高的幅度以及其他性状的改进等。 当前发酵工业中使用的高产变异菌株,大部分都是通过诱变而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种具有方法简便、快捷和收效显著等特点,所以仍然是目前被广泛使用的主要育种方法之一。 2.2 原生质体利用技术 基因重组是遗传的基本现象之一,菌株经过基因重组获得新的遗传型,从而获得具有优良性状的菌种。在工业微生物育种中,应用转化、转导或接合等重组技术来培育应用于生产实践中的高产菌株的例子还不多见,只是在1978年第二届国际工业微生物遗传学讨论会上提出了原生质体融合后,重组育种技术才获得了飞速的发展。 原生质体融合衍生的技术方法:(1)原生质体诱变方法,用以改善传统诱变育种的效果;(2)利用原生质体再生时对再生条件的控制,使菌株遗传特性发生改变的原生质体再生育种方法;(3)通过加热或UV照射处理,使参与原生质体融合的一方灭活的“定向”融合技术,灭活一方在融合过程中可将其遗传物质传递给有活力的受体原生质体。另一个好处是供体方可能会产生对受体原生质体有致死作用的酶或抗生素,热灭活可破坏这些不利因素;(4)利用原生质体进行染色体DNA转化,质粒DNA高频转化、原生质体的转染、利用脂质体进行原生质体的转化和转染技术;(5)原生质体融合技术和电子技术相结合的电融合技术:电诱导原生质体融合技术是将2个彼此靠近的细胞在电脉冲的作用下,两者发生质膜的融合,这种方法需专门的仪器-电融合仪,方法直观、定向、高效。目前用微生物完整细胞进行电致孔DNA转化成功的例子虽然还很少,但却颇引人注意,有可能为微生物转化提供一个更为有效的方法。(6)电穿孔法(electroporation),电压脉冲使电场中的细胞膜可逆地形成小孔,周围溶液中的外源基因得以进入细胞,这是一种将外源性分子(基因或外源DNA序列),引入细胞内的方法,用以进行转染或细胞融合。 所有这些新技术方法无疑均提高了原生质体融合的效率,扩大了原生质体融合的应用范围,特别是为基因工程中外源基因的转移提供了一种十分有效的手段。 2.3 结构材料的育种 20世纪70年代后,一个理论与实践密切结合,可人为控制的育种新领域——基因工程育种应运而生。它是在基因水平上,运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,与载体连接,然后导入另一细胞,使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达。与前几种育种技术相比,基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术,它可实现超远缘杂交,因而是最新、最有前途的一种育种新技术。基