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基于改进的融合pcr技术的同源重组序列构建 随着大规模重组计划的完成和大规模表达序列标记数据库（dap）的建立，结果基因组的研究逐渐从结构矩阵转变为功能基因组的研究。以同源重组技术为基础,通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体并取代基因组中野生型的等位基因,进而研究目的基因与表型性状间的关系,是研究动物、植物、微生物基因功能的一种非常有用的遗传操作方法。 同源重组的发生依赖于载体与目的片段间存在一定的DNA序列同源片段,同源片段越长越有利于同源重组事件的发生。传统的同源重组载体的构建以限制性内切酶和DNA连接酶为基础,通过一系列的酶切连接反应将各片段逐步连接起来。这种方法费时费力,不但在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列,而且对于长片段的连接有时难以找到合适的酶切位点。为了克服传统的同源重组载体构建方法的缺陷,出现了以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术——融合PCR技术(fusion PCR)。融合PCR技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下,采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。现有的融合PCR技术一般包括两步PCR反应:(1)应用特异性引物,对各片段进行独立扩增,特异性引物的5′末端带有一段相邻片段的互补序列;(2)在同一反应体系中加入各片段的混合物,以一对外侧引物进行融合片段的全长扩增。由于融合PCR技术正处于初步发展阶段,在应用过程中还存在很多方面的问题,如融合产物长度一般在4.0kb以下、待融合片段的个数一般不超过3个、产物特异性差等。Robert等应用融合PCR方法进行了3个片段的融合反应,获得了3个融合产物,融合产物长度最大为4.2kb。Majid等在进行4个片段的连接时,首先将425bp的alcA启动子片段和1.9kb的pyr4基因片段连接到pUC19载体上,得到一个2.1kb的pyr4-alcA表达盒,再通过两步PCR将2.1kb的pyr4-alcA表达盒与两个长度分别为410bp和513bp的片段进行了融合,最终才获得了一个由4个片段组成的长3.0kb的融合产物。 鉴于融合PCR技术中普遍存在的问题,本研究对现有的融合PCR技术进行了改进,构建了3个同源重组线性DNA片段(Albr和Blhr由3个片段融合而成,Clbrh由4个片段融合而成),并对改进的融合PCR技术的操作步骤、反应条件及技术要点进行了详细的论述。与原有的技术相比,改进的融合PCR技术增加了一个反应步骤,通过3个PCR反应,在一个反应体系中即可以快速实现3个片段和4个片段的融合反应。融合产物电泳条带清晰,产物特异性强,产物的长度分别达到了4.5kb、5.2kb和5.9kb。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 pcsn43研究 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T88菌株、大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、质粒pCSN43均由本实验室保存;质粒pBT6购自美国真菌遗传保存中心(Fungal Genetics Stock Center,FGSC)。 1.1.2 培养基的制备 马铃薯培养基(PDA):马铃薯200g,蔗糖20g,蒸馏水至1000ml;LB培养基:蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,固体培养基添加15g琼脂,去离子水至1000ml,固体和液体培养基在使用时按需要加入氨苄青霉素至100μg/ml、X-gal (40μg/ml)、IPTG (10μg/ml)。 1.1.3 enymemamax和gel花图 Pfu DNA Polymerase,Long PCR Enzyme Mix购自Fermentas公司;Gel Extraction Mini Kit购自上海华舜生物工程有限公司;pMD18-T载体购自宝生物(大连)有限公司。 1.2 dna分子手术 基因组DNA的提取、纯化,质粒DNA的提取、转化均参照文献。 1.3 pcr扩增产物 本实验分别构建了3个同源重组线性DNA片段(Albr,Blhr,Clbrh),Albr和Blhr由3个片段融合构成,Clbrh由4个片段融合构成。每个片段的融合反应均设了3次重复,各片段扩增所用引物及序列如表1所示。其中引物Al1、Al2、Ab1、Ab2、Ar1与Cl1、Cl2、Cb1、Cb2、Cr1序列相同,大写序列为扩增片段的特异性引物序列,小写序列为相邻片段的互补序列。 1.4 扩增条件及产物检测 按照常规PCR方法进行各目的片段的独立扩增。扩增使用Pfu DNA Polymerase,各片段扩增的反应条件及扩增产物长度如表2所示。扩增产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,确定目的条带,切胶Gel Extraction Mini Kit回收。凝胶制备过程中减少EB的加入量,要