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基因敲除技术的研究进展 基因（gene）是核酸分子信息的遗传单位。它是一个以多酚链或钠序列信息为储存所需的全部磷酸序列信息的序列。基因敲除 (Gene knockout) 是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法, 通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏, 使特定基因失活, 以研究该基因的功能;或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分, 以便测定它们是否具有相同的功能, 或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。 基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 此后经历了将近20年的推广和应用, 直到2007年10月8日, 美国科学家CAPECCHI和OLIVER SMITHIES、英国科学家EVANS因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖, 基因打靶技术才获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段 (即基因打靶) , 从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展, 除了基因打靶技术外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有RNA干扰技术, 同样也可以达到基因敲除的目的。本文就基因打靶技术和RNA干扰技术两个方面综述了基因敲除的方法及其应用。 1 基因打靶研究 基因打靶技术 (gene targeting) 是指基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA序列发生重组的性质, 来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术, 又称为同源重组技术。胚胎干细胞 (Embryonic stem cells, ESC) 是早期胚胎细胞经体外抑制分化培养建立的多能性细胞系, 体外培养时保持了未分化状态, 可以传代增殖, 在发育上类似于动物早期胚胎的内细胞团细胞, 具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点, 是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。ESC分离和体外培养的成功及哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的技术基础和理论基础, 是进行基因敲除研究不可替代的材料。 基因打靶的主要步骤包括: (1) 重组基因载体的构建:把目的基因和细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因的载体上, 此重组载体即为基因打靶载体, 载体要包括外源目的基因、同源基因片段及标记基因; (2) 导入受体细胞:用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内; (3) 筛选:用选择性培养基筛选已击中的细胞; (4) 检测:观察被击中细胞的生物学特征, 将已击中的胚胎干细胞转入胚胎使其生长, 对转基因动物进行形态学及分子生物学检测。基因打靶技术进行基因敲除目前使用相当广泛, 根据其作用方式不同可分为:条件性基因敲除法、诱导性基因敲除法、基因捕获技术基因敲除法等, 这些方法都是建立在DNA基因同源重组技术原理基础之上的, 现分别展开叙述。 1.1 组织特异性基因敲除 条件性基因敲除法是指将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上, 利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术, 在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”, 从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。自从1994年GU等的第一例应用Cre-LoxP系统研制的组织特异性基因敲除小鼠问世以来, 条件基因敲除技术迅速取代了传统的完全基因敲除成为主流。 条件基因敲除技术利用Cre-LoxP和FLP-FRT位点特异性重组酶系统使得时空特异性基因敲除变为现实。在特定阶段特定组织或细胞中表达Cre或FLP重组酶的转基因小鼠通过与在基因组中引入LoxP或FRT序列的小鼠交配, 可导致子代鼠中特定组织或细胞中的靶基因被删除。基于Cre-LoxP系统的第二代小鼠模型可以克服重要功能基因敲除所导致的早期致死表型, 模拟人类疾病相关的体细胞突变, 并对突变进行时空上的调控, 提供了激动人心的新机会研究已知或者未知基因的在疾病的起始、发生和治疗过程中的作用及其机制。近几年来, 利用细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosomes, BACs) 构建的Cre转基因载体通过受精卵注射得到了许多与内源性基因表达谱相似的Cre转基因小鼠。2007年Xu等将两种不同细胞特异性的Cre基因部分缺失的转基因小鼠交配得到了恢复Cre重组酶活性的子代小鼠, 从而对Cre在特定细胞中的表达达到了“双重”限制。在构建转基因载体时, 如果同时将Cre基因置于配体或药物可诱导的启动子控制下, 就可同时