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植物原生质体培养和细胞悬浮培养的测定 植物原生质体培养和植物细胞悬浮培养是植物遗传改良、二次代谢生产和生物基础研究的常用技术。 统计原生质体培养中的培养密度 (一般每ml培养液中应达到104~106个细胞) 和活力对实验的成功与否是很重要的。 由于植物原生质体, 尤其是由愈伤组织而来的原生质体直径比较大, 用常规的血球计数板统计原生质体数存在一定的问题。 如现在实验室一般采用的血球计数板为上海医用光学仪器厂的产品, 其槽的深度为0.1mm, “井”字形中央区的25个大格中的液体体积只有0.1 μl(0.1mm×1mm×1mm) , 而要求其中的细胞数应达到50~100个。 以此种计数板测定时, 我们发现很多原生质体会溢出方格, 即使已达到培养密度的原生质体悬浮液, 中央区方格中的细胞数也远远达不到50~100个, 因此计数很不准确。 为此, 我们根据教学与研究实践, 自行设计了一种简便的计数方法。 其操作流程如下: 1.测定显微镜物镜可视视野面积:以“COIC”倒置显微镜为例, 用镜台测微尺测得10×物镜的视野面积约为3.14×12=3.14 (mm2) ;25×物镜视野面积为3.14×0.42=0.5024≈0.50 (mm2) ;40×物镜的视野面积约为3.14×0.252=0.19625≈0.20 (mm2) 。 2.确定滴加原生质体悬浮液的体积:取擦干净的载玻片、盖玻片, 以18mm×18mm的盖玻片为例, 用移液枪在载玻片上依次滴加50、25、15、10、8、5、1 μl的鹰嘴紫云英原生质体悬浮液 (含0.5mol·L-1甘露醇) , 分别加盖玻片, 镜检, 重复3次。观察到滴加8 μl时, 原生质体单层排列, 盖玻片边缘没有溢出的细胞及液体, 悬浮液均匀布满盖玻片, 无气泡, 比较合适。这一步操作的标准与否是十分关键的。对于不同实验和不同植物材料, 滴加的悬浮液体积可能会有所变化。为了尽量减小误差, 确定滴加的悬浮液体积, 应以镜检时细胞单层排列、均匀布满在盖玻片上而不溢出或堆积在盖玻片边缘为准。 3.实例说明:从收集的1ml原生质体悬浮液中用移液枪吸取8 μl, 滴在载玻片上, 加盖18mm×18mm的盖玻片, 在40×物镜下镜检。如果6个不同视野原生质体的平均值是20个, 则其密度为: [ (1 000÷8) × (18×18÷0.20) ]×20=4.05×106(个·ml-1) 。 此法能快速便捷地测定原生质体或植物细胞的数目, 不会因其直径较大而影响计数准确性。经我们实验室的多次使用, 证明确实可行, 比较好地解决了植物原生质体计数这个一直存在的问题。