啤酒生产中酵母菌中乳酸菌的分离与鉴定.docxVIP

啤酒生产中酵母菌中乳酸菌的分离与鉴定 在啤酒生产过程中，对啤酒的质量至关重要。但实际生产中啤酒厂的酵母一般要连续使用多代,在循环使用过程中很容易染菌。乳酸菌是最容易污染、且危害较大的细菌。当使用受到乳酸菌污染的酵母进行啤酒发酵时,会导致啤酒产生丝状浑浊、酸味增加、双乙酰超标等质量问题。因而对酵母定期进行微生物检测、控制乳酸菌的污染是非常重要的。本文对种酵母中存在的乳酸菌进行了分离和初步鉴定。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 样品 连续使用5代以上的种酵母:取自济南某啤酒厂。 1.1.2 乳酸菌发酵葡萄糖产乳酸 UBA固体培养基:酵母膏6.1g,蛋白胨15g,葡萄糖16g,K2HPO40.31g,KH2PO40.31g,MgSO4·7H2O 0.12g,NaCl 0.006g,FeSO4·7H2O 0.006g,Mn SO4·4H2O 0.006g,番茄汁244mL,啤酒250m L,琼脂20g。蒸馏水定容至1000mL,p H6.0。 改良UBA固体培养基:UBA固体培养基中加入2%CaCO3。用来分离种酵母中的乳酸菌。 PYG培养基:蛋白胨0.5g,胰酶解酪朊0.5g,酵母膏1.0g,葡萄糖1.0g,盐溶液4.0mL,蒸馏水100m L,pH值自然。用来测定乳酸菌发酵葡萄糖产乳酸的情况。 盐溶液成分:无水CaCl20.2g,MgSO4·7H2O 0.48g,K2HPO41.0g,KH2PO41.0g,NaHCO310g,NaCl 2.0g,蒸馏水1000mL。 麦汁培养基:将粉碎的粗麦芽与水按1:4在63℃水浴中保温1h,升温至65℃继续保温1h,至碘检无色。糖化醪用纱布过滤,向滤液中加入30m L/L麦汁澄清剂,煮沸30min后过滤,麦汁糖度调至12°P。麦汁培养基用来测定低温下乳酸菌的发酵产酸性能。 1.2 方法 1.2.1 l.4.4结论 以无菌操作取25g酵母泥于装有225m L无菌生理盐水的500m L三角瓶中,振荡均匀。用1m L无菌移液管吸取1.0m L稀释液,注入到含9m L无菌生理盐水的试管中,按相同的方法逐次稀释到10-6。分别取10-4、10-5、10-63个稀释度的菌悬液0.1m L涂布在改良UBA固体培养基倾倒的平板上,30℃恒温培养5d,挑取产生溶钙圈的单菌落,反复划线分离至获得纯菌株,4℃斜面保存。 1.2.2 空间分布及形态特征检测 乳酸的定性测定:无菌操作取菌株1环,接入PYG培养基中,30℃培养48h。采用纸层析法定性测定PYG发酵液中是否含有乳酸,以确定产乳酸细菌。 纸层析法:(1)展开剂:水:苯甲醇:正丁醇以1:5:5混合,然后加1%甲酸。(2)显色剂:0.04%的溴酚蓝乙醇溶液,用0.1mol/L的NaOH调pH6.7。 将国产新华滤纸裁成25cm×25cm大小,在纸下方距边约3cm处画条横线,每隔3cm画一点作为点样位置。毛细管点样,用2%的标准乳酸溶液作为对照。将滤纸放入层析缸,先用展开剂饱和已点样的滤纸过夜,然后加展开剂开始层析。上行约20cm,取出晾干后喷显色剂,观察样品上行是否出现有黄色斑点,测量各显色斑点中心与点样点之间的距离d1和点样点到展开剂前沿的距离d2。计算Rf值:Rf=d1/d2 培养特征和形态特征鉴定:将菌株接种在UBA固体培养基倾倒的平板上,30℃恒温培养72h,观察菌落特征。挑取单菌落,涂片,革兰氏染色,显微镜下观察菌体形态。 生理生化特征鉴定:将菌株依次进行碳水化合物发酵产酸实验、过氧化氢酶实验、精氨酸产NH3实验、硝酸盐还原实验、明胶液化实验、H2S的产生实验等。 1.2.3 麦汁中酸菌的检测 500mL三角瓶中装250mL麦汁培养基,接入乳酸菌的菌悬液,使麦汁中菌液浓度约为0.5×103个/m L。12℃培养72h。每6h取样1次,测定酸度。以时间为横坐标,酸度为纵坐标绘制产酸曲线。 1.2.4 显微红色测定 发酵液1m L置于100m L三角瓶中,用50m L冷却后的蒸馏水稀释,以酚酞为指示剂,用0.1mol/L的Na OH标准溶液滴定至溶液显微红色,记录用去的Na OH标准溶液体积。酸度(°T)以100m L发酵液中的产酸量计,即: 2 结果与讨论 2.1 菌株的筛选 将种酵母的稀释液涂布在改良UBA固体培养基上,培养5d后,挑取平板上溶钙圈大的典型菌落。共得到5株菌种,依次命名为L1、L2、L3、L4、L5。 2.2 蘑菇的鉴定 2.2.1 l5菌pyg发酵实验 利用纸层析法对2%标准乳酸溶液和L1、L2、L3、L4、L5菌的PYG发酵液进行对比实验,结果见表1。 根据Rf值测定的结果,在纸层析中L2和L3发酵液的Rf值与乳酸的Rf值基本一致,说明菌株L2、L3能够发酵葡萄糖产生乳酸。 2.2.2 发酵葡萄糖的最佳条件 根据乳酸