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一测多评法测定鱼腥草中6个成分 鱼粪草是三白草科多年生草本植物的一部分。它是新鲜的草地。干燥的土壤。鱼腥草性味辛、微寒,具有清热解毒、消毒排脓、利尿通淋之功效,有较强的抗菌抗病毒作用。鱼腥草的有效成分为黄酮类、有机酸类、挥发油等。其中黄酮类主要有芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷及槲皮苷等。有机酸类主要有新绿原酸、绿原酸等。现代药理研究显示绿原酸类具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗白血病、降血脂、降血糖等生物活性,而芦丁、金丝桃苷及槲皮苷等黄酮类具有抗病毒、抗氧化、抗炎、抗肿瘤及保护肝脏和心血管等活性。《中国药典》未收载鱼腥草定量方法,文献对鱼腥草质量控制多为测定单一成分或同时测定其他较微量的成分,且需要独立对照品。为考察药效成分在鱼腥草不同部位的分布,本实验采用一测多评法以常见的绿原酸对照品为参照,建立与其余成分的相对校正因子,同时测定了泸州纳溪鱼腥草不同部位中所含的6个主要活性成分(新绿原酸、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷及槲皮苷)的量,为鱼腥草药材质量控制和评价提供更好的技术手段,也为鱼腥草作为原料药的选择及其质量标准提高研究提供科学依据。 1 色谱、色谱及标准品 Dionex高效液相色谱仪(包括P680A四元梯度泵,PDA—100二极管阵列检测器,TCC—100柱温箱和Chromeleon色谱工作站)。Agilent 1100高效液相色谱仪(包括G1311A四元泵、G1313A自动进样器、G1315B二极管阵列检测器、G1316A柱温箱和Agilent Chem Station工作站)。色谱柱:Akzo Nobel Kromasil C18、Lubex Kromasil C18、Phenomenex Luna C18(2)(均为250 mm×4.6 mm,5μm)。瑞士Precisa电子天平(XR 205SM—DR)。CQX25—06超声波清洗器(上海必能信超声有限公司,功率250 W,频率25 kHz)。 新绿原酸(批号070915)、绿原酸(批号080620)、芦丁(批号090618)、金丝桃苷(批号090802)、槲皮苷(批号091205)及异槲皮苷(批号091226)对照品均由成都曼思特有限公司提供。所有对照品经HPLC峰面积归一化法检测纯度均在98%以上。 鱼腥草采自四川省泸州市纳溪寿登寺,栽培品,经作者鉴定,为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草,分取全草、叶、花、茎及根,50℃烘干备用。乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。 2 方法和结果 2.1 分析的证实 2.1.1 萃取条件及分段变波长的测定 Akzo Nobel Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱:0~10 min,6%~8%乙腈;10~35 min,8%~27%乙腈;35~37 min,27%乙腈;37~38 min,27%~6%乙腈;38~40 min,6%乙腈;体积流量1.0 mL/min;分段变波长测定:0~25 min为326 nm,25~40 min为254 nm;柱温30℃;进样量10μL。 2.1.2 混合对照品溶液 分别精密称取新绿原酸、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷及槲皮苷对照品适量,以90%甲醇溶解并定容,制成质量浓度分别为新绿原酸1.913 mg/mL、绿原酸0.952mg/mL、芦丁0.575 mg/mL、金丝桃苷1.288 mg/mL、异槲皮苷0.677 mg/mL及槲皮苷1.725 mg/mL的对照品储备液,分别精密吸取0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,置25 mL量瓶中,以90%甲醇稀释至刻度,制得系列混合对照品溶液,避光保存。 2.1.3 超声处理法 取本品粉末(过4号筛)适量(全草、叶、花取约0.5 g,根、茎取约2.0 g),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入90%甲醇25 mL,称定质量,超声处理30 min,取出,放冷,再称定质量,用90%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,即得。 2.1.5 标准曲线的绘制 分别精密吸取系列浓度的混合对照品溶液10μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。以峰面积为纵坐标(Y),对照品质量(X)为横坐标,绘制标准曲线。同系列对照品制备方法逐级稀释,分别以信噪比3和10考察检测限和定量限,结果见表1。 2.1.6 仪器精密度试验 取同一混合对照品溶液,连续进样6次,记录各组分色谱峰峰面积。结果新绿原酸、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷及槲皮苷峰面积RSD分别为0.25%、0.30%、0.41%、0.33%、0.39%、0.36%,表明仪器精密度良好。 2.1.7 色谱峰峰面积测定 取同一供试品溶液,分别于制备后0、4、8、12、24、4