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牛双胎性状的多态检测 牛的繁殖性能直接关系到是否对人口生产的生产效率和市场需求的快速响应。现在，中国的牲畜养殖已经开始关注集中管理和规模化，并逐渐进入国际一体化。在中国的养牛业中，黄牛从传统的服务方式转变为肉用，优质的生猪新品种（系）被列入未来15年的全国牲畜发展计划。然而，牛属于一只单独的动物。通常，一个胎产一个小牛，繁殖率低。自然条件下，双胎率仅为0.15%2.99%，这极大地限制了养牛业的发展。因此，提高牛的繁殖率是半个世纪以来研究牛育种的一个热点。经过10多年的研究（1982-1993），双胎率从3.4%提高到28.5%。这表明，即使是对这种双胎的遗传因素也可以通过遗传改良来改善，但目前的遗传机制尚不清楚。根据这项研究，双胎率可以提高为28.5%。这意味着双胎有遗传基础，可以通过遗传改良。然而，目前尚不清楚遗传机制。根据这项研究，双胎和卵（esr）之间的遗传关系接近于1.00。因此，牛的研究表明，例如，rothschild等人以祖母遗传基因（esr）作为猪的育种方法，研究发现esr的存在于esr基因的等位基因b（3.7kg带）下。因此，if和zhao采用fsh基因作为改良后代（0.2kg）。研究结果表明，bb-纯合子（0.2kg）祖母比纯母猪高2.53头，平均产仔数为2.12头，最大产仔数为1.5%。 促卵泡素(FSH)是由垂体分泌的一种促性腺激素,它与卵巢上的FSH受体结合而激活cAMP路径,从而起到促进卵泡发育、成熟以及最终引发排卵.而对FSHR基因结构的研究表明,FSHR属于一个数目庞大的G蛋白耦合受体超家族的成员之一;这个超家族包括有大约100多个受体,肾上腺素能受体是其典型代表;该类受体蛋白肽链在功能和结构上分为跨膜域、胞外域和胞内域3部分,最显著的特点是跨膜域在细胞膜上来回折叠形成7段跨膜段;FSHR的10个外显子中,第10外显子编码胞内域和跨膜域,胞外域则由第1～9外显子编码.由此可见,第10个外显子的功能是非常重要的.Rahal等报道,发现了牛FSHR基因的第10外显子存在多态性,但尚未进一步确定与繁殖性状的关系,所以本研究以秦川牛和荷斯坦奶牛的双胎母牛为实验材料,对FSHR基因的第10个外显子的第1387 bp至1617 bp共230个碱基的区段进行了SNP(single nucleotide polymorphisms, SNP)分析,并与单胎牛对照,皆在探讨该基因作为候选基因标记牛双胎性状的可行性,以便于在双胎牛的选育中参考应用. 1 材料和方法 1.1 荷斯坦牛奶的采血 秦川牛20头,其中双胎母牛和单胎母牛各10头;荷斯坦奶牛32头,其中双胎母牛和单胎母牛各16头.静脉采血,肝素钠抗凝,酚、氯仿抽提后,TE溶解,-20℃保存. 1.2 引物的合成 依照参考文献设计一对引物,扩增片段长度为230 bp,为FSHR基因第10外显子的一部分.引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,序列如下: 上游引物:5′-ATCAC GCTGG AAAGA TGGCA TACC-3′ 下游引物:5′-GACAT TGAGC ACAAG GAGGG AC-3′ 1.3 聚丙烯酰胺凝胶的制备 取PCR扩增产物8 μl 于一灭菌离心管中,加入等体积的变性上样缓冲液(95% 去离子甲酰胺10 ml、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 200μl、0.25% 二甲苯青FF、0.25% 溴酚蓝).95℃水浴中变性5～10 min后,立即冰浴5 min以上,直至上样时取出.电泳采用8%的Acr/bis溶液为29∶1的聚丙烯酰胺凝胶,凝胶中加入5%的甘油.电泳结束后凝胶银染. 1.4 不同因素的pcr产物序列测量 对出现不同基因型的PCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳并回收,然后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序,对两个牛种均进行测序分析. 2 结果 2.1 sscp分析 用设计的引物对2个牛品种的基因组DNA进行PCR扩增,2%琼脂糖电泳检测,扩增片段与目的片段大小一致且特异性好(Fig.1),可直接进行SSCP分析. 2.2 正常型和突变型 对PCR扩增片段进行SSCP检测,结果出现两种基因型,正常型(纯合子,Fig. 2中3、5、6、7泳道)和突变型(杂合子,Fig.2中1、2、4、8泳道)这种现象在秦川牛和荷斯坦奶牛均存在. 2.3 fshr基因突变 对秦川牛和荷斯坦奶牛中出现的纯合子和杂合子两种基因型的PCR产物直接测序,测序结果发现,具有多态性DNA序列在FSHR基因的第1506个碱基发生了突变,即T→C. Fig.3列出了DNA序列和氨基酸序列. 2.4 单胎牛和双胎牛中突变体的显著性检验 牛不同群体突变频率列于Table 1.从表Table 1可以看出,无论秦川牛还是奶牛,FSHR基因第10个外