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内皮细胞生长因子对超长皮瓣存活与氧自由基的影响 血管内生长因子（vegf）是一种特定于血管内皮细胞的糖蛋白。它可以维持血管的正常状态和完整性，改善血管的渗透性，诱导血管的生成。这一点引起了组织修复和血管再生的高度重视。国内外学者对VEGF在不同类型皮瓣存活中的具体作用和相关机制做过一些报道,本实验制作大鼠背部超长随意皮瓣缺血模型,皮瓣内局部注射VEGF,为带蒂皮瓣较大创面和促进创面愈合探索新的治疗途径。 1 材料和方法 1.1 体质量与动物鉴定 实验于2004年11月—2005年11月在华北煤炭医学院中心实验室完成。选择清洁级健康成年雄性SD大鼠,体质量(300±20)g,由郑州实验动物养殖中心提供(动物合格证号为医动字第410117号)。自由饮水,室温(25±2)℃分笼喂养。 1.2 动物模型制备、分组及模型建立 干预模型:采用1%戊巴比妥液4ml/kg腹腔内注射,麻醉成功后俯卧位固定,背部剃毛。常规消毒后,以鼠背中线为皮瓣纵轴,设计以鼠骶骨下缘处为蒂,形成3cm×10cm缺血型皮瓣,皮瓣包括背部肉膜层,解剖在背部深筋膜浅面掀起,结扎重要血管,4-0丝线间断原位缝合。所有手术均由同一术者完成。距蒂部0～4cm为皮瓣近段,4～7cm为皮瓣中段,7～10cm为皮瓣远段。所有器械及材料均经过严格消毒且整个过程都在无菌条件下进行。 56只动物随机分为二组,每组28只。分别为生理盐水对照组(NS组)和VEGF实验组(VEGF组)。重组人血管内皮细胞生长因子(rhVEGF)由二条165个氨基酸多肽链组成。将VEGF溶于0.9% NaCl溶液中形成1μg/ml VEGF工作液。皮瓣形成后即刻,于术区远蒂端3cm×4cm选择10个对称位点,用微量注射器经组织面向皮下注入,VEGF组每一位点给予VEGF工作液100μl,每瓣共注入VEGF 1μg,NS组每一位点给予医用生理盐水100μl。皮瓣形成后第十二小时、二十四小时分别取6只大鼠,于距皮瓣远端2.5cm、5.5cm和8.5cm取材测定组织MDA含量和SOD活力。 于术后第四天取大鼠12只,按随机数分为生理盐水组和内皮细胞生长因子组,每组6只。给药方法同上。各组分别于皮瓣形成后第四天处死,进行组织学检查:动物麻醉后,取材固定,常规石蜡包埋切片,苏木精-伊红染色,光镜下观察组织学变化。 皮瓣形成后第七天,①皮瓣成活率测定:动物麻醉后,用透明硫酸纸准确描绘各组皮瓣形态,坏死区域用墨汁涂黑。坏死标准:皮肤质地变硬,颜色变黑。将描绘好的透明硫酸纸用扫描仪依次扫描后,利用真彩色医学图像处理系统(北京航空航天大学图像中心)对皮瓣资料进行处理和计算,求出皮瓣存活面积与总面积之比即皮瓣成活率。②皮瓣微血管密度测定:先行FⅧ-RAg免疫组化染色,步骤同增殖细胞核抗原免疫组化染色,一抗换作兔抗鼠FⅧ-RAg 多克隆抗体(1:50)。对FⅧ-RAg免疫阳性血管进行微血管密度计数,凡是染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞族,均作为一个血管计数,在低倍(×100)光镜下每张切片随机计算5个视野微血管数目,利用计算机全自动图像分析系统测量出相同视野下的组织面积,按血管断面均数/镜下视野组织面积,即可知道1cm2组织中血管断面的密度,单位为个/cm2。 1.3 主要观察指标 ①主要结局:组织中MDA和SOD指标的测定。②次要结局:皮瓣成活率、微血管密度的测定、组织学检查。 1.4 ss软件10.5版本 所有实验数据均用xˉ±sxˉ±s表示,以EXCEL建库,采用SPASS软件11.5版本进行统计分析。采用t检验,检验水准α=0.05。 2 结果 2.1 两组含vegf组的登记比较 应用分光光度计,根据TBA法测定MDA含量及黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力,并得出结果如下。术后第十二小时二组间的MDA和SOD比较差异无统计学意义。术后第二十四小时二组的结果见表1、2。 在术后第二十四小时测得皮瓣远端组织MDA含量二组间差异有统计学意义。结果:VEGF组(2.79±0.22)nmol/mgprot,较生理盐水组(5.42±1.35)nmol/mgprot,显著减少(P0.05)。 在术后第二十四小时测得皮瓣中、远端组织SOD活力二组间差异有统计学意义。结果:中端SOD活力VEGF组(116.61±19.83)nmol/mgprot,较生理盐水组(58.27±12.81)nmol/mgprot,显著减少(P0.05),而远端SOD活力VEGF组(177.07±3.41)nmol/mgprot,较生理盐水组(109.71±40.13)nmol/mgprot,显著减少(P0.05)。 2.2 专业活检成活率 根据全自动图像分析系统输出结果,皮瓣形成后第七天,各组皮瓣成活率见表3。内皮细胞生长因子组皮瓣成活率较生理盐水组明显增加(P