利用表面等离子共振传感器检测转基因植物中苏云金芽孢杆菌carloc12a蛋白.docxVIP

利用表面等离子共振传感器检测转基因植物中苏云金芽孢杆菌carloc12a蛋白 太阳金蘑菇（bt）是一种分布广泛的太阳阳性细菌。如果枝条形成，它将产生杀死活性物质的晶体蛋白质，称为寄生虫晶体蛋白（cp）。利用转基因技术将Bt基因导入植物中, 改良植物品种, 使改良后的植物具有抗虫基因, 可有效杀灭多种害虫。在节省害虫防治成本的同时, 还能缓解因大量施用农药而造成的环境污染。目前已有多种转Bt基因农作物实现了商业化种植, 如玉米、棉花、马铃薯、番茄等。然而, 由于转基因产品的安全性问题一直备受关注, 各国对于转基因产品的种植和进口都有着严格的规定, 因此研究出一种简便快捷地检测转Bt基因作物的方法具有重要的现实意义。本研究针对Bt蛋白中的Cry2A蛋白进行检测研究, Cry2A蛋白能同时杀灭鳞翅目害虫和双翅目害虫。 表面等离子共振 (surface plasmon resonance, SPR) 技术是近些年得到长足发展的一项应用于分析生物分子间相互作用的检测技术[9,10,11,12,13,14], 而表面等离子共振传感器便是基于这种技术的一种光学传感器, 它利用全反射时入射光可以和金属表面的等离子发生共振的原理, 检测生物分子之间的相互作用与结合过程以及动力学反应。相比其他检测方法, SPR方法具有以下几个优点:1) 检测样品不需标记, 避免了样品因为标记不当而失去活性;2) 可做到动态实时监测;3) 检测过程非常简便且灵敏度高。目前该技术已广泛应用于食品分析、蛋白质与核酸检测、药物筛选、临床医学等各个领域。本实验便是基于这种技术, 利用SPR传感器对Bt抗虫蛋白Cry2A进行了检测研究。 1 材料和方法 1.1 a中国上海有限公司 单侧镀金玻璃片 (12 mm×20 mm, 单侧镀金5 0 n m) 、S P R N a v i 2 0 0传感器芬兰BioNavis公司;蒸馏水;无水乙醇;30%氨水、30%双氧水均为分析纯;巯基十一酸 (11-mercaptoundecanoicacid, 1 1-MUA) Sigma中国上海有限公司;3-巯基丙酸 (3-mercaptopropionic acid, 3-MPA) 、脂肪酸甲酯磺酸盐 (fatty acid methyl ester sulfonate, M E S) 、N-乙基-N’- (二甲基氨基丙基) 碳二亚胺 (N- (3-dimethylaminopropyl) -N’-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC) 、N-羟基琥珀酰亚胺 (1-hydroxy-5-pyrrolidinedione, NHS) 、Cry2A蛋白及其单克隆抗体、牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 、磷酸盐 (phosphate buffered saline, PBS) 缓冲液 (20mmol/L Na H2PO4, 150 mmol/L Na Cl, p H 7.4) 、DHG-9030恒温干燥箱北京江阴滨江设备公司;Cry2A蛋白检测试剂盒美国Envirlogix公司。 1.2 方法 1.2.1 金片的表面清洗 将30%氨水、30%双氧水、蒸馏水按照1∶1∶5的体积比混合, 把金片置入其中, 于水浴锅中煮沸, 温度设置为80~90℃, 10 min后取出, 用蒸馏水及无水乙醇分别清洗金片表面, 氮气吹干表面, 以便用于后续实验。 1.2.2 主要表面活性剂 将10 mmol/L 3-MPA溶液与10 mmol/L 11-MUA溶液以10∶1的比例混合, 把金片镀金的一面朝上置于其中, 浸泡24 h;取出金片, 用蒸馏水及无水乙醇冲洗金片并用氮气吹干, 于金片表面滴加100μL EDC (0.4 mol/L) , 100μL NHS (0.1 mol/L) (EDC、NHS均用MES溶解) 以活化金片表面的硫醇羧基, 室温静置2 h后用蒸馏水及无水乙醇清洗金片, 氮气吹干, 再次滴加100μL EDC, 100μL NHS, 室温静置2 h;蒸馏水及无水乙醇清洗并吹干金片, 金片表面滴加100μL Cry2A单克隆抗体溶液 (0.2 mg/m L, PBS稀释) , 37℃恒温箱中静置3 h;蒸馏水洗去表面抗体溶液, 氮气吹干, 2 mg/m L PBS稀释, 覆盖于金片表面, 室温静置2 h, 用蒸馏水将金片表面清洗干净, 吹干, 置于PBS中4℃保存。 1.2.3 温度设定及过程 取出金片, 用蒸馏水洗净, 氮气吹干, 将金片放入SPR传感器的指定位置中, 打开仪器和监测软件, 通入PBS (使用前需超声) , 流速为10μL/min, 待反应池及棱镜温度达到设置温度后进行初始角度扫描 (一般将反应温度设置为低于室