应用dna重组技术构建大鼠鳞状神经节神经营养因子真核表达载体.docxVIP

应用dna重组技术构建大鼠鳞状神经节神经营养因子真核表达载体 cndt是一个含有20-24kd的酸性蛋白质，可以显著促进中枢神经和周围运动神经元的生存，防止因破坏而转移到血管。近年的基础研究发现神经损伤后采用组织工程方法, 将有活性的种子细胞移植治疗神经损伤, 能促进损伤轴突修复、再生, 恢复部分神经功能。近年种子细胞应用的相关研究逐渐成为神经组织工程的热点, 肌源性干细胞也备受广大学者关注。肌源性干细胞是高度未分化的多潜能细胞, 具有长时间强大的自我更新能力;在特定刺激下, 其可以分化为成骨细胞, 肌细胞, 心肌细胞, 神经细胞等, 可以作为神经组织工程的理想细胞。 本实验通过真核表达载体pEGFP-C3-CNTF的构建并转染成肌细胞, 促使成肌细胞稳定表达CNTF, 探讨真核表达载体pEGFP-C3-CNTF转染的成肌细胞作为神经组织种子细胞的可行性。 1 材料和方法 设计:随机对照的实验研究。 时间及地点:实验于2011-4/2011-12在辽宁医学院实验室完成。 1.1 菌种和质粒 实验动物:新生3～5d的SD大鼠乳鼠 (10g±2g) , 由辽宁医学院实验动物中心提供, 动物许可证号:SCXK (辽) 2003-2007。 菌种和质粒: 菌种:E.coli DH5α为本实验室保存。 质粒:pDBLeu-CNTF, pEGFP-C3均为本实验室保存 实验分组: 转染pEGFP-C3-CNTF重组质粒的成肌细胞组 (成肌-CNTF细胞) 作为实验组, 转染pEGFP-C3空载体的成肌细胞 (成肌-mock细胞) 组作为对照组。 1.2 重组质粒的构建和表达 (1) 引物设计与合成 引物设计与合成由上海生工生物工程有限公司完成, CNTF引物上游序列为:5, -CTTTCGCAGAGCAAACACCT-3, , 下游序列为5, -CATCCCATCAGCCTCATTTT-3, , 应用RT-PCR技术扩增CNTF cDNA 目的片段.1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所得扩增产物是否为目的片段。 (2) 构建真核表达载体 采用分子克隆技术构建其真核表达载体。对PCR扩增的目的片段CNTF p-EGFP-C3质粒经Xho I和BamH I双酶切, 1.0%琼脂糖凝胶电泳后胶回收CNTF目的片段和载体pEGFP-C3片段, 经T4 DNA连接酶16℃连接过夜, 产物转化入感受态大肠杆菌E.coli DH5α菌株, 用含卡那霉素 (50 ms/L) 的LB琼脂平板培养, 随机挑选10个单克隆, 以菌落为模板进行PCR初步筛选。重组真核表达载体命名为p-EGFP-C3-CNTF。鉴定正确的阳性克隆, 在含卡那霉素 (50 mg/L) 的LB培养液中培养过夜, 抽提重组质粒后, 以质粒为模板双酶切鉴定并将阳性克隆进行测序。 p-EGFP-C3-CNTF质粒转染成肌细胞 参照Lipofectamine2000试剂盒 (LF2000, Invitrogen公司) 说明书采用阳离子脂质体介导两组质粒 (pEGFP-C3-CNTF和pEGFP-C3) 转染成肌细胞。 原代培养成肌细胞生长至70%～80%汇合时, 以无血清培养液冲洗细胞1次。用p-EGFP-C3空质粒和pEGFP-C3一CNTF重组质粒转染成肌细胞, 各转染12孔。分别于转染后24h和48h在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况以检测转染效率。抗生素筛选稳定转染的细胞系。扩增培养获得的能稳定表达大鼠CNTF的成肌细胞, 命名为成肌-CNTF细胞, 作为实验组;将作为对照的稳定转染pEGFP-C3空质粒的细胞命名为成肌-mock细胞。设β-actin为内参, 引物设计, 引物上游序列为:5, -GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3, , 下游序列为:5, -GGACTCATCGTACTCCTGCT-3, , RT-PCR检测CNTFmRNA的表达情况。 观察p-EGFP-C3-CNTF质粒转染的成肌细胞向神经元样细胞分化并鉴定 用神经元特异性蛋白 (NES) 鉴定神经元样细胞, 经免疫组化染色后, 在显微镜下拍照并计数阳性细胞占细胞总数的比例。 主要观察指标:RT-PCR扩增检测CNTF基因片段;Desmin鉴定成肌细胞;神经元特异性蛋白 (NES) 鉴定神经元样细胞, 于镜下观察细胞形态并计数阳性细胞占细胞总数的比例。 设计、实施、评估:实验设计为第一作者在第三作者指导下完成, 实施为第一、二作者, 评估为第三作者。 1.3 统计分析x=sxs 2 pegfp-c3-cnrt重组质粒的鉴定 2.1 重组质粒的双酶切鉴定 重组质粒pEGFP-C3-CNTF经Xho I和BamH I双酶切后可得到两条分别为422bp及4726bp的条带, 而pEGFP-C3空质粒双酶切