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氧化型谷胱甘肽-二茂铁的合成及性能研究 氨基葡萄糖是指由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过氨基酸化合物形成的生物活性三醇化合物，包括还原型（gsh）和氧化型（gssg）。广泛存在于生物体中，对生物的生理活动起到了重要作用。许多情况下GSSG被认为只是GSH通过硒谷胱甘肽过氧化物酶、转氢作用、抗氧化作用的一种产物。锌是人体所需基本元素之一,在临床、抗炎、抗氧化和免疫方面都起着重要的作用。谷胱甘肽在生物体内起着对Zn2+的运输、代谢作用。例如Maret等利用65Zn标记金属硫蛋白,研究了GSSG促进Zn2+从金属硫蛋白中释放出来,并转移到另一个蛋白质分子,表明GSSG对生物体内Zn2+的代谢起着重要作用。L等认为通过GSSG的氨基和α-羧基,Zn2+能与GSSG形成1∶1的配合物。同时有人通过核磁共振证实了这一结果。因此研究Zn2+与GSSG的相互作用对诠释金属离子与生物分子相互作用有着重要的意义。 二茂铁具有良好的电化学特性和独特的夹心型结构,且易与多肽、蛋白质和DNA等生物分子结合形成具有电化学活性的共扼化合物,已成为生物电化学研究领域的热点。Anne等用二茂铁标记寡核苷酸固定于金电极表面,建立了一个通过循环伏安法探究短链DNA柔韧性的新模型。Hyk等利用电化学方法研究了S-二茂铁-谷胱甘肽在低离子强度溶液中的扩撒与迁移性能以及讨论了在水溶液中p H对S-二茂铁-半胱氨酸迁移性能的影响,但还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基与二茂铁直接相连,阻断了GSH的活性。我们课题组合成了具有游离巯基的二茂铁-谷胱甘肽,并将其应用于Cd2+的测定以及与蛋白质相互作用的研究。目前,未见报道用二茂铁标记氧化型谷胱甘肽(GSSG)进行电化学研究。 在本研究中,将具有电化学活性的二茂铁与氧化型谷胱甘肽(GSSG)结合,得到氧化型谷胱甘肽-二茂铁(Fc-GSSG-Fc),用循环伏安法研究了Fc-GSSG-Fc在水溶液中的电化学性能及其与Zn2+的相互作用。实验结果表明化合物Fc-GSSG-Fc与Zn2+形成配位比为1∶1的配合物,为诠释生物体内锌与谷胱甘肽之间的相互作用机理提供了一种新的研究方法。此外,由于文献报道将二茂铁引入到一些生物分子中具有抗菌活性以及携带药物穿过血脑屏障的功能,而GSSG与肿瘤和帕金森病存在着一定的联系,因此Fc-GSSG-Fc将具有潜在的生物生理活性。 1 实验部分 1.1 样品与表面活性剂 二茂铁甲酸(苏州昊帆生物科技有限公司,A.R.);柱层析硅胶(青岛海洋化厂,30~50μm);苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU)及1-羟基苯并三唑(HOBt)购自上海吉尔生化有限公司;氧化型谷胱甘肽(GSSG)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自Sigma公司;二氯甲烷(CH2Cl2)经氢化钙干燥重蒸。其他试剂均为市售分析纯试剂,所用水均为二次蒸馏水。 AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司),UV-2450紫外-可见吸收光谱仪(日本本岛津公司),AMX-500核磁共振谱仪(Bruker),LCT高分辨质谱仪(美国Waters公司),ZF-I三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂),电化学工作站(CHI-440,上海辰华仪器有限公司)。 1.2 实验方法 1.2.1 fc-gssg-fc在不同固相胶合反应中的循环伏安测试 以玻碳电极为工作电极,Ag/Ag Cl电极为参比电极,铂丝(Pt)电极为对电极。将化合物Fc-GSSG-Fc配成0.5 mmol·L-1的水溶液,加入0.1 mol·L-1的KCl作为支持电解质,缓冲溶液为30 mmol·L-1TrisHCl(p H=7.4)溶液,进行循环伏安测试,扫描速度为0.1 m V·s-1,扫描范围为0~0.8 V。另外取等量0.5 mmol·L-1的Fc-GSSG-Fc溶液于不同试管中,分别加入不同量的Zn2+,每个试管中Fc-GSSG-Fc的终浓度为50μmol·L-1,混合均匀,反应4 h后进行微分脉冲伏安测试。每次测定前电解池通入10 min氮气除氧。 1.3 茂铁的合成 参照Kraatz等将二茂铁偶联到多肽、氨基葡萄糖的方法,将二茂铁甲酸与氧化型谷胱甘肽(GSSG)反应,合成了氧化型谷胱甘肽-二茂铁(FcGSSG-Fc),其合成路线见图1。 1.4 fc-gssg-fc3.2的合成 化合物Fc-OBt(2)的合成参考Kraatz和王蓓等的方法。称取二茂铁甲酸(1)(5 mmol,1.15 g)溶于无水CH2Cl2溶解,0℃缓慢滴加1.4 m L Et3N,再依次加入HBTU(6 mmol,2.28 g)和HOBt(6 mmol,0.81 g),反应1 h,旋转蒸干,得粗产物。用柱层析法(展开剂VEt OAc∶Vhexane=2∶1,Rf=0.36)对粗产物进行纯化,