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犬卵母细胞体外培养技术研究进展 辅助生殖技术是利用人工方法帮助男性和卵之间的结合的技术。它可以分为：ivm）、精细保存；ivf）、工艺精湛；ai）和胚胎移植（et）。辅促生殖技术在牛羊等一般家畜生产中已广泛应用,而在犬上的应用研究相对落后。笔者对犬辅助生殖技术的研究进行了综述。 1 元素对小鼠卵母细胞的活性影响 犬属单次发情动物,发情前期和发情期长是区别于其他哺乳动物的一大特点。由于排卵时间不易掌握,难以获得自然排出的卵母细胞,这给犬的体外受精和胚胎发育研究造成极大困难。通过卵巢卵母细胞体外培养获取大量成熟卵母细胞,然后体外受精获得胚胎的方法越来越受到人们重视。 目前有关IVM的研究报道较多,内容主要集中在筛选培养液组成成分的研究方面。常用犬卵母细胞体外培养液大致可分为2种:单纯培养液和混合培养液。广泛使用的单纯培养液主要有改良Kreds Ringer重碳酸盐溶液(mKRB)和人工合成输卵管液(SOF);混合培养液主要是TCM199。 目前混合培养液TCM199被认为是犬卵母细胞培养的最好基础培养液。虽然在犬的卵母细胞体外培养液研究中有一定进展,但是犬的IVM成功率不高,通常只有20%。制约犬IVM成功率的因素主要是: (1)卵母细胞的形态。Theiss T的研究表明,卵母细胞的直径、细胞质色泽、胞浆内鞭毛的发育程度或透明带破裂与否等都对犬卵母细胞的体外培养产生影响。Hewitt DA研究发现直径100μm的IVM成熟率(19%)高于直径≤100μm(10%)的卵。 (2)颗粒细胞的完整性。犬卵母细胞核成熟的完成与颗粒细胞的扩散程度呈负相关。颗粒细胞在卵母细胞的发育过程中起合成类固醇激素的作用,同时颗粒细胞中还存在各种促使卵母细胞发育的激素受体,颗粒细胞扩散或崩解会阻断FSH和LH等激素对卵母细胞的作用途径,进而影响IVM。 (3)培养液中激素添加剂。Srsen V等研究发现,在整个培养期使用促性腺激素(FSH/LH 1ug/mL的联合或单独使用)并不能提高核成熟率;Rodrigues等还发现,无FSH的培养液可防止卵母细胞减数分裂的中断,但对随后减数分裂的进行并无促进作用;而Songsasen等最近的研究显示,将犬的卵母细胞暴露在eCG(马绒毛促性腺激素)中60～240 min,能使减数分裂的恢复率和进入MI期的百分率提高,这种有利影响可能是由于eCG的FSH活性作用。但Hanna等实验表明,添加eCG对犬卵母细胞恢复减数分裂和达到MII期的比率比对照组要低,eCG能促进卵丘扩散,是减数分裂的抑制剂。这可能是由于促性腺激素对犬颗粒细胞合成类固醇激素的作用时间不同。添加促性腺激素的效应可能也受到培养液中类固醇激素的影响,这些激素之间的复杂关系更好地反映了排卵前卵泡的生理环境。但有报道,在2种浓度的雌二醇与促性腺激素联合使用时,对卵母细胞的成熟并未显示任何影响。 (4)培养液中蛋白因子添加剂。通常在培养液中添加的蛋白因子主要是热灭活血清或血清白蛋白,血清通过促进卵丘细胞增殖,增强颗粒细胞功能及刺激卵丘扩散等一系列机制影响IVM。Otoi T在犬的IVM研究中添加超过10%的胎牛血清(FCS)可以提高卵母细胞的成活率,而对其成熟无有利影响。以前血清多用FCS,现在部分学者主张用发情动物的血清(EDS),认为其中含有较高激素浓度和更合理的激素组合。研究表明,同时添加EDS和FSH可提高成熟率,证明两者有协同作用。比较添加发情犬和发情牛血清,发现添加发情犬血清对于犬卵母细胞成熟至MI-AI期的效果优于添加发情牛血清(10.4%～4.2%),但两者均未能使卵母细胞成熟至MII期。而Otoi T等用10%的发情犬血清使卵母细胞完全成熟的比率达16.3%,而乏情犬血清只有11.1%。血清中成分比较复杂,除了含有蛋白质外,还含有促性腺激素、类固醇激素、生长因子等因子。因此难以确定在添加血清后究竟是哪种促进了卵母细胞的成熟。而且血清不同批次产品差异较大,导致各实验室结果不一。 2 精子保护和人类生产 2.1 萃取精华 3 发发运炎对卵母细胞的影响 由于犬排卵时间不易掌握,难以获得自然排出的卵母细胞,这给犬的体外受精和胚胎发育研究造成极大困难。有关犬卵母细胞IVF的研究报道较少。Mahi C.A.等利用自然发情犬卵巢上的囊状卵泡的卵母细胞,经体外培养和体外受精,获得原核胚;S.Yamada等利用诱发发情犬卵巢上囊状卵泡进行体外成熟和IVF,获得8细胞胚胎,但成熟率、受精率和卵裂率都很低。陈振文等就发情犬与未发情犬的卵母细胞对IVF的影响进行了实验研究,认为发情犬卵巢卵母细胞单精受精率和原核形成率显著高于未发情犬卵巢卵母细胞,而两者的不可见卵泡卵母细胞的单精受精率和原核受精率基本相同。因而推测发情犬卵母细胞受精率高于未发情犬的卵母细胞的原因是,可