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利用乌骨鸡产蛋白酶解花青素的工艺研究 乌骨鸡是世界上罕见的珍稀鸟类。它集药物、补充和营养于一体，对人体具有特殊的营养功能。乌骨鸡与普通鸡最明显的差异就是含有黑色素。研究表明,乌骨鸡中的黑色素具有保护功效,可以避免紫外线引起的急慢性改变;具有清除自由基,抗氧化等功能,从而可以预防癌症,抗衰老,提高肌体的免疫力。 由于乌骨鸡黑色素与蛋白质结合在一起,对于乌骨鸡黑色素的分离,主要采用盐酸降解蛋白质的方法,其他方法尚未见报道,但是该法可能造成黑色素形态和化学结构的损伤。本实验拟采用蛋白酶法分离黑色素,并对黑色素的抗氧化性能进行了研究,旨在找出酶法分离乌骨鸡黑色素的最佳工艺条件,为乌骨鸡食品的开发提供一定的理论依据。 1 材料和方法 1.1 试验材料 泰和乌骨鸡:购自江西省泰和县生物谷食品科技工业园;大豆色拉油(市售),DPPH(sigma)。 1.2 碱性蛋白酶和果汁活性 537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP碱性蛋白酶(酶活力均≧10万单位,上海酶制剂厂);木瓜蛋白酶(酶活力≧6000万单位,国药集团化学试剂有限公司)。所用化学试剂均为分析纯。 1.3 乌骨鸡黑色素提取工艺 全净膛乌鸡→清洗→剔骨取肉→绞碎→加酶、调pH、恒温水解→酶水解液→离心→滤渣→清洗→黑色素 1.4 实验计划 1.4.1 最佳酶解工艺确定 参照文献,称取一定量绞碎混匀的乌鸡肉进行酶解实验,根据水解液中氨基态氮含量确定试验用酶种类。采用黄金分割法,依据水解液中氨基态氮含量确定最佳酶解工艺条件。酶解后将水解液离心(5 000 r/min,20 min),沉淀物用醚、蒸馏水反复洗涤(至少4次),经真空冷冻干燥得黑色素。 1.4.2 抗黑色素酶 测定黑色素对DPPH·的清除能力;同时将黑色素添加到油脂中,根据酸价变化间接测定其抗氧化性能。 1.5 测量 1.5.1 氨基氮的测定 1.5.2 dppha/l的测定 DPPH·法。将黑色素配成以下浓度:0.05 mg/mL,0.1 mg/mL,0.2 mg/mL,0.25 mg/mL,0.3 mg/mL,0.4 mg/mL,DPPH·用95%乙醇配成1×10-4mol/L的溶液,向2 mL DPPH·溶液中加入2 mL样品溶液,总体积为4 mL,摇匀,于25℃水浴中放置30 min后倒入光径为1 cm的比色皿,记录517 nm吸光值为A样品(用2 mL 95%乙醇与2 mL样品液调0点,以扣除试剂本身颜色的影响),向2 mL DPPH·溶液中加2 mL相应样品溶剂,记录吸光值为A空白,即空白对照。抑制率计算公式: 抑制率η(%)=(A空白—A样品)/A空白×100% 1.5.3 油酸价测定 酸碱中和法。 2 结果与分析 2.1 乌鸡肉蛋白质的水解 选用537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP碱蛋白酶、木瓜蛋白酶4种蛋白酶,按固液比(乌鸡肉∶水=1∶4,酶解时间4 h,酶用量(相对于乌鸡肉重的质量分数) 2%,在各自的适宜反应条件下,水解乌鸡肉,测定水解液中氨基态氮含量(经实验证实,乌鸡肉中黑色素质量与水解液中氨基态氮含量之间高度线性相关,其相关系数达0.9939,因此,为了研究方便,采用水解液中氨基态氮含量来间接反映乌鸡肉中的黑色素的含量)。结果见表1。 由表1可知,4种蛋白酶对乌鸡蛋白质的水解效果不同,酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶对乌鸡肉有较强的水解能力,分别达到0.264 4 g/100 mL、0.240 3 g/100 mL;碱性蛋白酶水解能力最差,只有0.0565 g/100 mL。由于酸性蛋白酶酶解条件温和(30～50℃),便于水解操作,因而将其选为水解乌鸡肉蛋白质用酶。 2.2 酶解条件的确定 2.2.1 实验结果及讨论 取pH3.0,温度40℃,固液比1∶4,酶解时间4 h,实验结果见表2。 由表2可知,在固定底物下, 氨基态氮含量随加酶量的增加而增加,但加酶量达到3.8%以后,不再增加,说明底物可能已被酶饱和,因而加酶量可确定为3.8%。 2.2.2 不同黄金分割法确定最佳酶解温度的确定 已知酸性蛋白酶作用范围在30～50℃,根据黄金分割法确定最佳酶解温度的试验点,其结果见表3。 从表3可知,温度为34.8℃为最佳酶解温度。 2.2.3 黄金分割法确定最适ph 已知537酸性蛋白酶在pH2.0～4.0之间稳定,超过此范围,失活较严重,由黄金分割法,在pH2.0～4.0含优区间内找出最适pH,经实验测得最适pH=2.8(表4)。 2.2.4 氮含量对水解能力的影响 在相同条件下,底物浓度不同,其水解效果亦有差异(表5)。 由表5可知,固液比为1∶2时,氨基态氮含量最多,水解能力最强,超过或低于这一值时, 水解能力均降低。当底物浓度增大时黏度也增大,影响酶分子的扩散和定向,不利于酶与底物充分接触,因而酶