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生姜中6-姜酚的提取工艺研究 1 生姜—引言 生姜是多年生草本植物的一种。它的根是肥沃的，扁平的，芳香的。2005年版药典一部收载该品种, 全国各地均有分布。生姜味辛性温, 长于发散风寒、化痰止咳, 又能温中止呕、解毒, 临床上常用于治疗外感风寒及胃寒呕逆等症, 前人称之为“呕家圣药”。其主要有效成分为姜辣素, 而6-姜酚是姜辣素中的一大类成分。因此, 本实验采用正交试验设计结合高效液相色谱法 (HPLC) , 以6-姜酚的含量为评价指标, 对6-姜酚的最佳提取工艺进行研究。 2 实验部分 2.1 仪器和试剂 2.1.1 紫外-可见分离器 LC-20A型液相色谱仪 (日本岛津公司) ;SPD-20A型紫外-可见检测器 (日本岛津公司) ;25μL手动进样器 (日本岛津公司) ;HT-20型柱温箱 (日本岛津公司) 。 2.1.2 测定项目及方法 6-姜酚标准品 (天津马克生物技术有限公司, 批号 归一化法测定含量大于98%) ;乙腈为色谱纯 (江苏汉邦科技有限公司) ;甲醇色谱纯和分析纯 (江苏汉邦科技有限公司) 。 2.2 实验方法 2.2.1 正交实验的设计 根据文献报道及预实验结果, 选择甲醇提取。影响甲醇提取的主要因素有浸泡时间、甲醇用量、提取时间, 以上3个因素, 每个因素选择3个水平进行L9(34) 正交实验, 因素水平安排见表1。 2.2.2 6-姜酚的含量测定 2.2.2. 流动相、柱线 色谱柱:迪马Kromasil C18(5μm, 250mm×4.6mm) ;流动相:乙腈∶水=44∶56;检测波长:280nm;流速:1.0mL/min;柱温:30℃;理论塔板大于2000;进样量:10μL。色谱图见图1。 2.2.2. 色谱法测定色液 准确称取6-姜酚标准品3.96mg, 用甲醇 (色谱纯) 溶解后, 转移至10mL棕色容量瓶中, 加甲醇 (色谱纯) 至刻度, 摇匀。量取上述标准品溶液5mL, 置25mL容量瓶中, 加甲醇 (色谱纯) 至刻度, 配成浓度为0.0000792g/mL的标准品溶液, 摇匀, 即得标准品溶液。 2.2.2. 样品溶液的提取 称取生姜末0.5g, 根据已选定提取工艺条件加入甲醇 (分析纯) , 浸泡, 67℃下水浴回流提取, 冷却, 补足失重, 即得样品溶液。进样前用0.45μm微孔滤膜滤过。 2.2.2. 线性关系的考察 取同一浓度的6-姜酚标准品溶液 (0.000198g/mL) , 分别准确吸取1、2、4、6、8mL置于10mL棕色容量瓶中, 加甲醇 (色谱纯) 稀释至刻度, 摇匀, 即得不同浓度的对照品溶液。每一浓度分别注入色谱仪10μL, 按上述色谱条件测定峰面积值, 以峰面积 (y) 为纵坐标, 进样量 (x) 为横坐标进行线性回归, 得回归方程为:y=571333x-15112 (r=0.9999) 。表明6-姜酚在进样量0.198—1.584μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。校准曲线见图2。 3 结果与讨论 3.1 精密度实验 准确吸取上述对照品溶液10μL, 重复进样6次, 测得峰面积, 计算RSD为0.3052%, 表明精密度良好。 3.2 重复实验 制备6份供试品溶液, 分别测得峰面积并计算6-姜酚的含量, 其RSD值为0.4015%, 表明重现性良好。 3.3 进样检测峰面积值 取同一份供试品溶液, 分别于0、2、4、6、8、12、24h进样测定峰面积值, 计算RSD值为1.8874%。表明样品含量在24h内稳定。 3.4 加标回收、测定 分别制备5份同一浓度的供试品溶液, 每一样品中加入相同量的6-姜酚标准品, 依法测定, 平均回收率为99.65%, RSD为1.9832%。 3.5 正交实验结果和离散度分析结果 见表2、表3。 3.6 试验的结果 称取生姜末3份, 每份0.5g, 根据已经选择的工艺提取制备。验证实验结果见表4。验证实验结果表明, 所筛选的提取工艺基本稳定。 3.7 样品处理方法的确定 (1) 由表2中R值可知, 各因素对试验结果的影响依次为BCA;由于A因素与空白项的R值相等, 这样可以认为A因素的R值是由实验误差引起的, 所以要将其与空白项一起作为实验误差项, 即SSe。方差分析结果表明, 因素B对试验结果有非常显著的影响, 而A和C的影响不显著。综合各种因素, 选定6-姜酚的最优提取工艺为A1B2C2, 即0.5g生姜末, 25mL甲醇水浴提取1h。 (2) 样品处理方法的确定:本实验曾采用甲醇为溶剂, 分别进行超声提取和水浴回流提取, 结果发现水浴回流提取的效果较好, 提取率大。分别以甲醇和乙醇作为提取溶剂进行比较, 结果发现甲醇的提取效果要优于乙醇。以不同浓度的甲醇为提取溶剂提取6-姜酚, 比较后发现, 以