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角膜炎罕见致病真菌对抗真菌药物敏感性研究 真菌性角膜炎是一种膜性感染疾病，通常表现为角膜炎。由于缺乏理想的广谱抗真菌药物,加之角膜生理的特殊性,临床致盲率很高,为此,选择敏感有效的抗真菌药物早期治疗对患者的预后至关重要。我们选择了三种角膜炎致病真菌的临床分离株,参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)制订的用于丝状真菌的体外药敏试验方案(M38-A)中的微量肉汤稀释法,选取临床上常用的抗真菌药:氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和两性霉素B进行了体外药物敏感试验,现报告如下: 1 ilacinus和束状刺盘孢 茄病镰刀菌(Fusarium solani)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)和束状刺盘孢(Colletotrichum dematium)各一株,均为角膜炎患者的临床分离株,保存于第二军医大学附属长征医院真菌室。根据M38-A方法选取近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)ATCC22019为质控菌株。 1.2 标准制剂 氟康唑由上海三维制药有限公司提供,酮康唑由福建金山制药有限公司提供,伊曲康唑由西安杨森制药有限公司提供,两性霉素B由上海新先锋药业有限公司提供,以上药物均为标准粉剂,药物纯度达99.9%。依据M38-A方案配置上述药物的储备液,用二甲基亚砜(DMSO,德国Merck公司)作为溶剂配成浓度为1280μg/ml的储备液,-20℃保存备用。 1.3 培养基ph值的调整 马铃薯葡萄糖培养基(PDA),RPMI-1640培养基(美国Life Technologies Inc,用0.165M MOPS将其pH值调整到7.0)。 1.4 氟康唑溶液的配制 菌悬液配制 提前将试验菌株接种在PDA上,28℃培养7d,活化2次。在孵育7d的培养管中,加入5ml的生理盐水,将菌苔沿琼脂表面轻轻刮下,和生理盐水一起倒入灭菌研磨器中,充分研磨后4层无菌纱布过滤,倒入无菌试管。以RPMI-1640培养基作为稀释液,在光学显微镜下用血细胞计数仪调整菌液浓度到1～5×104CFU/ml。 药敏反应板的制备 取氟康唑储备药液用RPMI-1640稀释到256μg/ml,其余储备药液用RPMI-1640稀释到128μg/ml。使用一次性无菌96孔板,每孔加入RPMI-1640培养基100μl,第11孔作为阴性对照再加100μlRPMI-1640培养基。按10级倍比稀释法将相应的药液加入第1～10孔中,每孔100μl,第12孔作为阳性对照不加药液,待下一步直接加菌液100μl。酮康唑、伊曲康唑和两性霉素B的浓度范围为64～0.125μg/ml,氟康唑的浓度范围为128～0.125μg/ml。所有操作都在超净台中进行。 加菌孵育 将配置好的菌液100μl加入相应各孔,除外第11孔。轻轻混匀后放入28℃孵育,72h判读MIC。 MIC判定 用肉眼观察法判定终点,与阳性对照孔比较,氟康唑和酮康唑取80%的生长抑制作为终点判定,伊曲康唑和两性霉素B取100%的生长抑制为终点判定。 2 种常用药物对刺盘孢mic值的影响 ①所有阳性对照(无药)均有菌生长,所有阴性对照(无菌)均无菌生长。②质控株与3株试验菌的72hMIC见表1。其中束状刺盘孢的MIC值最低,茄病镰刀菌次之;淡紫拟青霉的MIC值最高;4种临床常用药物对试验菌的体外活性依次为酮康唑≥两性霉素B≥伊曲康唑氟康唑。氟康唑对茄病镰刀菌和淡紫拟青霉的MIC值高达64μg/ml。质控株ATCC22019的MIC值在规定的范围内。 3 抗真菌药物敏感试验 真菌性角膜炎是一种严重的致盲性疾病。近十年来,由于皮质激素和广谱抗生素的广泛应用,该病的发病率不断上升,且少见致病菌和新致病菌不断增多,资料显示其发病人数占所有化脓性角膜炎的6%～50%。由于早期诊断困难和缺乏特效的抗真菌药物,大约有1/3真菌角膜感染会导致药物治疗失败或者角膜穿孔,该病在角膜移植手术中占首位。至今已发现可引起角膜炎的真菌有70余种,我国主要的致病菌属为镰刀菌属(33.3%～65%)、曲霉菌属(20.5%～30.7%)、青霉菌属(3.6%～11.6%)、弯孢菌属(1.2%～13.1%)、念珠菌属(0.5%～2.9%)和其他菌属(9.0%～9.7%)。目前,眼科常用的局部抗真菌药物有两性霉素B、那他霉素和氟康唑,酮康唑和伊曲康唑等用于口服。那他霉素价格昂贵未能普及;两性霉素B毒性大,眼部刺激症状明显;氟康唑眼内通透性较好,刺激性小,抗真菌谱广,但其抗真菌作用不如两性霉素B;且由于临床上唑类药物广泛应用导致耐药菌株增多,临床单用咪唑类药物治疗的有效率52%。因此,体外抗真菌药物敏感性试验对于筛查敏感菌株或耐药株,指导临床治疗有较大意义。束状刺盘孢和淡紫拟青霉是临床罕见的机会致病菌,但近来发病日渐增多,目