浊点萃取-高效液相色谱法测定虾肉中孔雀石绿和结晶紫.docxVIP

浊点萃取-高效液相色谱法测定虾肉中孔雀石绿和结晶紫 甲壳动物绿色（mg）和三苯甲酸钠（cm）是三苯甲酸钠的资源。这两种化合物对鲤鱼、鲤鱼、鲤鱼等鱼类的水霉病和寄生虫也有很好的疗效。它们在鱼体内可以代谢为无色孔雀石绿色和无色结晶紫。由于其母体化合物和代谢物均具有潜在的致癌性,孔雀石绿和结晶紫已被欧盟和美国FDA禁用于水产养殖业。我国农业部第193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中也将孔雀石绿列为禁用药物。但是,由于其抗菌效果好,价格便宜,不少养殖户仍在违规使用,因此,孔雀石绿和结晶紫的残留监控就显得格外重要。 目前,孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、液质联用法及毛细管电泳法。我国于2004年发布水产行业标准《水产品中孔雀石绿残留量的测定液相色谱法》及GB/T 20361—2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定——高效液相色谱荧光检测法》均使用液相色谱法。孔雀石绿和结晶紫是禁用的,所以使用检测方法检测限越低越好。为了提高孔雀石绿和结晶紫的检测灵敏度,往往采取对样品溶液进行富集的措施。常采用的萃取富集方法有:固-液萃取、液液萃取、样品净化-固相萃取等。 浊点萃取(cloud point extraction,CPE)方法近年来日益受到重视。其优点主要有:1)有浓缩多种分析物的能力;2)不易燃、不挥发、安全和消耗小;3)废弃后的表面活性剂容易处理(容易在废丙酮或乙醇中燃烧);4)富集分析物的表面活性剂能与液相色谱的流动相相容,可以直接注入液相色谱仪检测。目前浊点萃取方法已用于萃取微溶的金属螯合物,分离疏水蛋白以及用于多种有机化合物的富集和分离。但这种方法用于虾中孔雀石绿和结晶紫的萃取尚未见报道。 本文建立了浊点萃取-高效液相色谱法同时检测虾肉中孔雀石绿和结晶紫的液相色谱方法,为快速检测虾中孔雀石绿和结晶紫提供操作简单、可用于日常分析的方法。 1 材料和方法 1.1 u3000标准储备液及标准工作原理 孔雀石绿:98.0%,上海标本模型厂;结晶紫:99.5%,天津市化学试剂研究所。精密称取孔雀石绿、结晶紫各0.100 0 g,分别用二次重蒸水溶解并定容至100 mL,此溶液(质量浓度为1 000μg·mL-1)作为标准储备液。聚乙二醇6000 (PEG-6000),配成200 g·L-1溶液;硫酸铵、对甲苯磺酸均为分析纯,乙腈为色谱纯。乙酸盐缓冲液:将4.95 g无水乙酸钠及0.95 g对甲苯磺酸溶于950 mL水中,用冰乙酸调节溶液pH值为4.5,最后用水定容至1L。 LC-20AT高效液相色谱仪、SPD-M20A二极管阵列检测器,LCsolution色谱工作站,7725 (i)手动进样器(日本岛津公司),Lichrospher ODS C18色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm);岛津UV-1700紫外可见分光光度计(日本岛津公司);HH-S26S数显恒温水浴锅;Anke TDL-40B离心机。 1.2 盐液两相分离 将待测液5 mL放入15 mL刻度试管中,依次加入0.75 mL 200 g·L-1PEG-6000,(NH4)2SO42.5 g,用蒸馏水定容至10 mL,充分摇匀,使加入的盐能够完全溶解;在60℃恒温水浴锅中放置25min,等两相分离后,3 500 r.min-1离心10 min,使两相完全分离,用针筒吸去下层水相,用流动相定容富集相至0.5 mL待测。经过浊点萃取后,富集相体积与定容前溶液相比浓缩了20倍。 1.3 加热2so 虾肉样品去头、壳、肠腺,取可食肌肉部分切成小块,称取(0.50±0.05) g虾肉,加入0.2 mol·L-1三氯乙酸2 mL,超声30 min。过滤后上清液置于干净的15 mL离心管中,虾样残渣再用5 mL重蒸水清洗,与上清液合并。按1.2方法加入PEG-6000和(NH4)2SO4,在60℃水浴中加热25 min,然后3 500r·min-1离心10 min。最后得到两相,用针筒吸出水相,用流动相将富集相定容到0.5 mL进样。 1.4 流动相、柱温、温度 色谱柱为ODS C18色谱柱(粒度5μm,4.6mm×250 mm);流动相:乙腈与0.125 mol·L-1乙酸盐缓冲溶液(pH 4.5)(体积比为80:20),用前过0.45μm滤膜;流速:0.8 mL·min-1;柱温:室温;检测波长:600 nm;进样量:20μL。 2 结果与讨论 2.1 最大吸收波长确定 在200～700 nm波长范围内对孔雀石绿和结晶紫标准品溶液进行波长扫描,发现孔雀石绿和结晶紫的最大吸收波长分别为618 nm和588 nm(图1)。为同时进行色谱分析,选择600 nm为检测波长。 2.2 流动相流速和质量浓度 以乙腈-乙酸铵缓冲溶液体系为