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河豚毒素停搏液对离体大鼠心肌细胞内游离ca 随着心肌缺血及重新注入机制的阐明，传统的高钾离心分离剂（miri）可导致心脏肌肉细胞中的na和负荷，导致ca2超载和心肌损伤。近年来,有学者研究提出一种新的心肌保护方法-极化停搏,可提高整体缺血心脏的心肌保护。本研究主要应用激光扫描共聚焦显微镜技术,观察Na+通道阻滞剂河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)停搏液对单个心肌细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响,从细胞水平上探索极化心脏停搏对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制。 1 材料和方法 1.1 无ca2+k-h液和sth2的水体抗氧化酶系统 透明质酸酶(华美生物工程公司),Fluo-3/AM(北京鼎国,Sigma国内分装),离子载体A23187(Sigma),河豚毒素(TTX,Sigma Chemical Co.USA)。胶原酶Ⅱ、牛血清白蛋白(BSA)、胰肽酶、无水二甲亚砜、台盼蓝、EGTA、HEPEs等均由第三军医大学惠利试剂中心提供。无Ca2+K-H液(Krebs-Henseleit buffer)成分(mmol/L):NaCl 130, KCl 4.8, MgSO41.2, NaHCO32.5, NaH2PO4-2H2O 1.2,Glucose 12.5,HEPEs 12, pH 7.4(使用前95%O2+5%CO2持续氧合)。消化酶液Ⅰ组成:胶原酶Ⅱ(0.43 mg/ml),透明质酸酶(0.3 mg/ml),无Ca2+K-H液50 ml。消化酶液Ⅱ组成:胶原酶Ⅱ(0.43 mg/ml),透明质酸酶(0.3 mg/ml),胰肽酶(2 mg/ml),BSA(0.2%),无Ca2+K-H液50 ml。STH2(St.Thomas Ⅱ号)心脏停搏液成分(mmol/L):NaCl 110, KCl 16, MgCl216, CaCl21.2, NaHCO310, pH 7.8;TTX心脏停搏液成分:22 μmol/L TTX+1 mmol/L Ca2+K-H液,pH 7.4(使用前持续灌注95%N2+5%CO2)。 1.2 心肌组织病理学检查 成年Wistar大鼠6只(重庆医科大学实验动物中心提供),体质量250～300 g,雌雄不限。经腹腔注射肝素化,20 min后颈关节脱位处死,开胸取心脏,连接并建立Langendorff灌注模型。用酶解法分离制备心室肌细胞悬液,灌流液温度控制在37 ℃并持续注入95%O2+5%CO2。先用1 mmol/L Ca2+K-H液,以灌注压5 kPa灌注约5 min。然后依次灌注无Ca2+K-H液5 min,消化酶液Ⅰ循环灌注20 min,消化酶液Ⅱ循环灌注10 min。之后取下心脏,在7.5 ℃含1% BSA和0.3 mmol/L Ca2+K-H液的培养皿中取左心室并剪碎,用200 μm尼龙网单层过滤并以上述液体洗涤3次,滤液以离心力50×g离心2 min,弃上清,依次用7.5 ℃含0.6 mmol/L Ca2+K-H液、7.5 ℃含1.0 mmol/L Ca2+K-H液混匀离心2 min。最后用37 ℃ 1.0 mmol/L Ca2+的K-H液制成单个心室肌细胞悬液,台盼蓝检测细胞活性(细胞存活率95%),备用。以上液体使用前均注入95%O2+5%CO2。 1.3 模拟样品阶段 全组共6枚成年Wistar大鼠心脏,用酶解法分离成具有搏动性的单个心室肌细胞悬液,取100 μl细胞悬液滴于载玻片上,制备多份并放入37 ℃的5%CO2培养箱孵育2 h取出备用。每枚心脏的心室肌细胞悬液均随机分成基础组、STH2组和TTX组。基础组为未停搏组,用来测定停搏前细胞[Ca2+]i。STH2组和TTX组分别为STH2停搏组和TTX停搏组。一份用来测定复搏后细胞[Ca2+]i,即分别加7.5 ℃STH2停搏液和TTX停搏液停搏心肌细胞,并在7.5 ℃下保存2 h,用95%O2+5%CO2氧合的37 ℃ 1.0 mmol/L Ca2+K-H液进行复搏(即建立模拟缺血/再灌注损伤的停搏/复搏细胞模型);另一份用来测定停搏期间细胞[Ca2+]i动态变化。 [Ca2+]i的测定:每个标本分别用50 μl钙荧光指示剂Fluo-3/AM(2 μmol/L)37 ℃避光染色30 min,轻轻洗脱细胞外的钙荧光指示剂后,置于激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS NT,瑞士)样品台,用488 nm激光激发Fluo-3/AM指示剂钙荧光,测定单个细胞内荧光强度,并减去背景荧光强度,通过公式[Ca2+]i=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)计算出单个细胞[Ca2+]i浓度。 Fmax测定:将孵育2 h的心室肌细胞悬液,用含A23187(10 μmol/L)和Fluo-3/AM( 2 μmol/L)的