下丘脑室旁核ap敏感性钾离子通道在大鼠炎性痛中的作用.docxVIP

下丘脑室旁核ap敏感性钾离子通道在大鼠炎性痛中的作用 炎性痛的相关因素包括周围组织损伤、缺血、缺氧和酸中毒。临床治疗中的炎症疼痛是医生面临的难题。目前的研究主要集中在炎性痛与受体、离子通道、神经递质的关系上。在炎性痛条件下, 伤害性神经递质, 如组胺和5-羟色胺等的释放增加, 刺激了外周和中枢神经系统伤害性感受器, 从而提高神经细胞的兴奋性, 增加背根神经节、脊髓和脑组织痛相关物质的表达。ATP敏感性钾离子通道广泛表达于中枢神经元, 并调节其膜兴奋性、神经递质的释放和参与神经保护。研究表明, 侧脑室内注入KATP通道开放剂克罗卡林和吡那地尔可以增强皮下注射吗啡引起的镇痛作用, 这种增强效应可以被KATP通道特异性阻断剂格列本脲消除, 提示这种镇痛作用的发挥与KATP通道有关。DAMGO (一种μ阿片受体激动剂) 注入丘脑中央下核 (thalamic nucleus submedius, Sm) , 减少脊髓背角c-Fos表达和抑制畏惧行为, 而这种效应可以被核团内预先注射格列本脲所阻断。这说明KATP通道可能在脊髓上水平参与疼痛信号调控。越来越多的研究显示, 下丘脑室旁核参与疼痛调控。因此, 本研究采用一种常用的动物疼痛模型———CFA诱导的炎性痛模型, 用免疫组织化学的方法观察炎性痛条件下下丘脑室旁核神经元中KATP通道的表达变化和伤害性行为相关的脊髓背角c-Fos的表达, 为进一步理解炎性痛的发病机制及探讨KATP通道在炎性痛中的作用提供参考。 1 材料和方法 1.1 各类抗兔、二氮嗪和金属酶 兔抗kir6.2一抗 (1∶200, Alomone Labs, 以色列) ;c-Fos一抗 (1∶400, Abcam, 美国) ;FITC标记的驴抗兔 (1∶200, Millipore公司, 美国) ;组化试剂盒 (北京中杉) ;二氮嗪 (Sigma, 美国) ;激光共聚焦显微镜 (FV1000, Olympus, 日本) ;热痛敏刺激仪 (IITC series 8-390型, 中国医学科学院生物工程研究所生产) 。 1.2 动物的使用原则 Sprague-Dawley大鼠, ♂, 250~280g, 由徐州医学院实验动物中心提供。饲养在12 h/12 h明暗光线交替、22~24℃的安静环境中, 自由进食、水。所有实验均遵守《实验动物使用规范》。采用随机数字法分为5组 (每组6只) :正常组 (Normal组) 、完全弗氏佐剂致炎性痛组 (CFA组) 、生理盐水对照组 (Saline组) 、KATP通道特异性激动剂二氮嗪组 (Diaoxide组) 和激动剂溶媒对照组 (Vehicle组) 。 1.3 慢性炎性痛模型的建立 将大鼠轻轻固定, 用100μl微量注射器, 尽快将用生理盐水稀释后的100μl浓度为50%的完全弗氏佐剂 (CFA) 注入大鼠左侧后肢足底中心皮下, 建立慢性炎性痛模型。对照组仅足底皮下注射生理盐水100μl。CFA足底注射后大鼠产生典型的外周炎症表现, 包括:注射局部的红、肿、疼痛等, 持续时间大于1周。 1.4 大鼠侧脑室模型 在致炎后d 3, 大鼠直接以水合氯醛麻醉 (300 mg·kg-1体重, ip) , 参照《大鼠脑立体坐标图谱》 (Paxinos and Watson) , 于立体定位仪 (日本) 上向大鼠一侧侧脑室[前囟: (-1.6~1.8) mm;深: (7.8-8.0) mm;中缝向左右旁开 (0.3-0.6) mm]注射二氮嗪 (diaoxide) 25ng (溶于0.3μl 0.5%DMSO中) 。注射后15、30、60、240 min后检测热痛阈。 1.5 热痛敏刺激法 在相同的时间段、相同的室内温度和湿度下进行测定。按照Hargreaves法, 将大鼠放置于3mm厚的15 cm×15 cm×15 cm的有机玻璃箱中, 待大鼠在其中适应30 min安静后, 用热痛敏刺激仪照射大鼠左后肢足底后外侧。从照射开始至大鼠出现抬腿回避的时间为TWL。光源刺激强度恒定不变。自动切断时间为25 s, 以防止组织损伤。每只动物连续测定5次, 测量间隔3 min, 取后3次比较平稳的数据平均值为大鼠TWL。 1.6 腰髓细胞处理u2004大细胞菌群的表达 大鼠用10%水合氯醛 (300 mg·kg-1) 腹腔注射麻醉后, 经左心室-升主动脉插管, 依次灌注37℃生理盐水150 ml冲洗和4℃、4%多聚甲醛溶液300 ml固定, 总灌注时间为1~1.5 h。取大脑组织和脊髓后, 放入4%多聚甲醛溶液中4℃后固定过夜;转入30%蔗糖溶液中4℃脱水至组织沉淀。冰冻连续冠状切片, 荧光片厚40μm, 取相应脑组织节段的切片;取腰脊髓L4-5节段切片, 片厚30μm。用0.01 mol·L-1PBS (N