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生物化学与分子生物学实验中碱法提取质粒的原理辨析 生物化学和药理学的实践是学生掌握基本技术、提高科学思维能力和独立运行能力的有效途径。由于基因工程的基本技术广泛地应用在科研和生产实践中,操作相对简单,结果明确,所以在分子生物学实验教材中都将质粒提取,转化,鉴定和表达作为一个完整的综合性实验开设。本实验室从2001年起也开设了这一综合实验,使学生对分子生物学技术有了感性认识,提高了学生的学习兴趣。碱裂解法制备质粒是项常规技术,虽然实验操作相对简单,结果也非常明确,但是有关实验的一些原理和机制仍值得我们探讨,辩析。我们根据自身多年的实践和对各院校采用的实验教材分析,对实验原理和结果中容易造成误解的解释作了些总结,以供同行商榷。 1 葡萄糖对质粒提取的影响 碱法提取质粒是一种简单,快速有效的方法,广泛地用于科研,也是分子生物学实验教学的基本技术。但是在碱法提取质粒的原理叙述中,不同的教材各有说法,甚至出现一些明显与理论相悖的解释,这样很容易使学生误解和迷惑。有必要对该法的原理辨析。 碱法提取质粒主要试剂是三种溶液,一般称溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ。它们的组成见下:溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,pH值8.0;溶液Ⅱ:0.2mol/L NaOH,1%SDS;溶液Ⅲ:3mol/L醋酸钾,2mol/L醋酸。 溶液Ⅰ的主要作用是悬浮细菌菌体,使菌体悬浮均匀,不能有结块,否则影响质粒提取。溶液中的葡萄糖使溶液密度增加,可以减缓大肠杆菌沉积到管底部的速度;此外,在溶液Ⅱ裂解细胞时,葡萄糖溶液可以避免菌体破裂后,产生的压力变化造成细菌DNA被剪切力打断,影响提取质粒的纯度。但实际应用时,我们发现溶液I中不加葡萄糖对质粒提取影响不大,葡萄糖需要与否是可选择的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,可以抑制DNase的活性。 溶液Ⅱ的作用主要是破坏细菌,使质粒从细胞内释放。其中0.2mol/L的NaOH是主要的细胞裂解试剂,NaOH可以使细胞膜破坏,同时伴随蛋白质和核酸变性。变性的蛋白质空间结构被破坏,形成无规则的多肽链;DNA的氢键被打断,但是由于大肠杆菌的基因组DNA和质粒DNA均是双链闭环DNA分子,所以无论基因组DNA,还是质粒DNA的两条DNA链都不会游离成单链的DNA分子。大肠杆菌基因组DNA较长,可以与多肽链相互缠绕,相对分子量小得多的质粒不易与多肽链缠绕。1%十二烷基硫酸钠(SDS)的主要功能不是破坏细胞,而是分散缠绕的多肽链,与多肽链形成SDS-多肽复合体,使变性蛋白质溶解在溶液中,使多肽链更好地与基因组DNA缠绕。注意,一些教材中认为变性DNA沉淀是错误的,不管是变性的DNA,还是双链DNA分子均溶解在水中。 有的同学做到这步时,会问蛋白质变性为什么不会沉淀?实际上强碱和强酸虽然可以使蛋白质变性,但由于溶液pH值过高或过低,变性的蛋白质不会沉淀,而且1% SDS具有助溶解的作用。所以溶液Ⅱ加入后,细菌悬液由混浊转变成清亮透明的溶液。由于强碱性环境容易破坏DNA链,这一步不能停留过长时间,一些教科书要求室温放置5min,实际上只要上下颠倒混匀5次即可,此时以溶液变清亮透明为准,没必要室温放置5 min。进行这步操作时千万不要用混合器混合,否则获得的质粒将杂有基因组DNA的片断。 溶液Ⅲ的主要作用是沉淀变性的蛋白质和基因组DNA。加入溶液Ⅲ后会有大量的沉淀。什么原因造成大量的沉淀呢?一些教材认为是醋酸中和碱,使变性蛋白质沉淀;还有些教材认为加入溶液Ⅲ后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了。这些解释都是错误的,变性的蛋白质可以很好地溶解在1%～2%的SDS溶液中(做过SDS电泳就知道,蛋白质是用SDS溶液溶解的);至于DNA,无论是变性的DNA,还是复性的DNA,DNA分子在中性溶液中都能溶解。实际上造成变性蛋白质大量沉淀的主要原因不是醋酸,而是十二烷基硫酸钾。十二烷基硫酸钾中的钾离子是醋酸钾带入的,钾离子置换了十二烷基硫酸钠中的钠离子,生成十二烷基硫酸钾沉淀。由于十二烷基硫酸盐与变性蛋白质结合成复合体,十二烷基硫酸钾的沉淀就将变性的蛋白质沉淀,同时变性的蛋白质与基因组DNA缠绕,结果也大部分被共沉淀了。而高离子浓度的溶液又加速了这一沉淀过程;此外,溶液被中和后变性蛋白质表面电荷减少,也可以促进变性蛋白质沉淀。如果将醋酸钾换成等量的醋酸钠是否也有相同结果呢?我们实验发现,这样处理可以出现少量的沉淀,这是溶液被中和及溶液离子强度增加造成的少量变性蛋白质沉淀,醋酸钠代替醋酸钾处理获得的质粒含有大量的蛋白质和基因组DNA。 2 重组质粒的检测 碱法提取的质粒一般在琼脂糖电泳中可以出现1～3条带。经典的实验教材一般认为按迁移率快慢这3条带分别是超螺旋,线性和开环结构的质粒