家族性高胆固醇血症患者家系低密度脂蛋白受体基因的克隆与分析.docxVIP

家族性高胆固醇血症患者家系低密度脂蛋白受体基因的克隆与分析 高脂肪家庭性祖母硬化（fh）是一种常染色体显性遗传疾病，是导致动脉硬化（as）和早期冠状动脉粥样硬化的重要危险因素。该病的病因是低密度脂质炎（ldl-r）的突变，导致腺体功能异常。在英美等发达国家,55岁以下的冠心病患者中5%～10%为FH患者。研究LDL-R基因突变对探讨LDL-R导致AS机制和防治冠心病具有重要意义。目前在FH患者中已发现900余种LDL-R基因突变和大量的单核苷酸多态性。国内外在华人FH患者中已发现LDL-R基因51种突变,但以国外研究占多数,国内研究相对滞后。本文对1例临床诊断为FH纯合子的先证者及家系成员进行临床检查;采用流式细胞仪检测先证者及其父母外周血淋巴细胞LDL-R表达量和功能;并对LDL-R基因进行PCR结合核苷酸序列分析,以发现我国LDL-R基因突变的新类型,探讨其分子病理机制。 1 对象和方法 1.1 血浆置换后1年生fh 北京安贞医院AS门诊收治1例男性患者,18岁,肘、膝、踝关节多部位皮肤黄色瘤及肌腱黄色瘤逐渐增大,双眼可见角膜弓,在未服用降脂药情况下,TC 16 mmol/L,血浆置换后1年仍未见下降。根据我国临床诊断FH标准:成人血清TC7.8 mmol/L;16岁以下儿童TC6.7 mmol/L;或成人LDL-C4.4 mmol/L,患者或亲属有腱黄色瘤者诊断为纯合子FH,未达纯合子标准者诊断为杂合FH。该患者诊断为FH纯合子。知情同意后以该患者为先证者收集与其有血缘关系的亲属,共收集到51例,并根据FH诊断标准:TC6.19 mmol/L诊断FH。 1.2 颈动脉内压监测 对先证者及其家系成员进行常规体格检查、病史采集,并采用氧化酶法测定血清中TC、LDL-C、TG含量,采用免疫沉淀法测定载脂蛋白AI(ApoAI)和载脂蛋白B100(ApoB100),ELISA法测定Lp(a),根据临床FH诊断绘制家系图确定遗传方式。 采用美国飞利浦公司生产的HP4500型、西门子公司Sequioa512彩色超声诊断仪,探头频率为3～11 MHz,取颈动脉长轴切面,在距分叉处约1 cm范围内颈总动脉处停帧,测量先证者及其父母颈动脉内膜-中膜厚度(IMT),并采用同样方法同时检测其外周血管情况。超声判断标准为:IMT0.10 mm为内膜增厚,IMT0.12 mm视为斑块形成。采用美国ACUSON公司SequoiaC256型彩色多普勒显像仪,常规检测心脏和瓣膜的结构;采用注射泵对先证者静脉注射腺苷(140 μg·kg-1·min-1),应用无创性经胸多普勒结合二次谐波技术,测量注射前后最大冠状动脉扩张状态下的冠状动脉血流与静息状态下冠脉血流的比值——冠状动脉血流速度储备(CFVR),以评价冠状动脉的生理功能。 1.3 ladl-r和cd3抗体的流式细胞仪检测 根据我实验室已建立的流式细胞仪检测细胞LDL-R表达量和功能的方法,以新鲜外周血经溶血素处理后分别加入FITC标记的抗人LDL-R的抗体和LDL,并加入PE标记的CD3抗体,分别在4℃和37℃条件下孵育,流式细胞仪检测各标本的平均荧光强度,与正常人比较来评估其细胞表面LDL-R表达量和结合、内化LDL的功能。 1.4 受影响基因及其突变的分析 1.4.1 糖凝胶电泳鉴定 提取先证者基因组DNA,扩增ApoB100基因3500区域的片断309 bp。琼脂糖凝胶电泳鉴定:对鉴定后的PCR产物经正反双向核苷酸序列分析及与正常序列比对,排除由ApoB100基因3 500附近位点突变导致的家族性Apo B100缺陷症(familial defective apolipoprotein B-100, FDB)。 1.4.2 核苷酸序列分析 参照我实验室已建立的降落式PCR方法扩增先证者LDL-R基因启动子和全部18个外显子,琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并送交北京三博测序公司进行核苷酸序列分析,分析结果经BLAST分析后,如发现错义突变点将其父母的该片段同样进行核苷酸序列分析。 2 结果 2.1 家系及外周血管检测结果 先证者双眼可见角膜弓,肘、膝、踝关节多部位皮肤黄色瘤及肌腱黄色瘤且逐渐增大(图1),其他家系成员未见类似体征。先证者血清TC、LDL-C水平明显增高,而TG水平正常范围;其父母TC水平虽较先证者低,但也明显高于正常值,分别为12.1 mmol/L、9.5 mmol/L,符合FH杂合子临床诊断(表1)。家系成员中共有14人符合FH诊断标准(表2)。根据先证者及其家系成员临床FH诊断绘制家系图(图2),符合显性遗传方式。外周血管超声显示:先证者双侧颈动脉轻度狭窄(直径狭窄35%～45%),左颈IMT为0.21 cm;右侧颈总动脉可见小斑块形成;左侧股总动脉内膜略增厚;双侧椎动脉、锁骨