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氨基酸对绵羊胚胎体外培养的影响 1949年，hammod用生理盐水和卵黄将8-细胞的小鼠胚胎培养到囊培，打开了外生殖器的序列。根据雌性生殖道内分泌液中氨基酸的变化规律,认为氨基酸对胚胎发育是很重要的。 Eagle氏以大鼠细胞生长为基础研究了非必需氨基酸(NEAA)和必需氨基酸(EAA)对细胞生长发育的影响。在培养液中添加NEAA可以提高许多动物胚胎的发育能力,但与含有血清的培养液相比,胚胎的细胞数要少一些,NEAA可能还不能提供胚胎发育的全部氨基酸。Zhang等(1990)报道,在培养液中添加1倍浓度的Eagle氏EAA有利于大鼠胚胎的发育,也有报道EAA对小鼠、仓鼠、绵羊和牛胚胎发育具有抑制作用。可见氨基酸对胚胎发育的作用仍需探讨。本研究的目的就在于探讨Eagle氏EAA和NEAA对绵羊胚胎早期发育的影响。 1 材料和方法 1.1 实验设计 1.1.1 动物和胚胎的来源 从屠宰场获得绵羊卵巢,采集2～5 mm卵泡中未成熟卵母细胞,经体外成熟、体外受精,用于胚胎的早期培养。 1.1.2 养羊剂、菌株对难血酸丙二酸钠基础培养液单次给药后大鼠胚胎发育的影响 实验1:以KSOM (K+-Simplex-Optimized-Medium)为对照组,添加7 mmol/L(1组)、14 mmol/L牛磺酸(2组),研究牛磺酸对绵羊胚胎发育的影响;实验2:以KSOM添加7 mmol/L牛磺酸为基础培养液(对照组)、添加NEAA0.25倍(1组)、0.5倍(2组)、1倍(3组),研究NEAA对绵羊胚胎发育的影响;实验3:基础培养液同实验2(对照组)、添加EAA 0.25倍(1组)、0.5倍(2组)、1倍(3组),研究EAA对绵羊胚胎发育的影响;实验4:基础培养液同实验2(对照组),添加0.5倍EAA+0.5倍NEAA(1组)、0.5倍EAA+1倍NEAA(2组)、1倍EAA+0.5倍NEAA(3组)、1倍EAA+1倍NEAA(4组),研究EAA和NEAA不同组合对绵羊胚胎发育的影响。 1.1.3 测试指标 在体外受精后第7 d,测定各组胚胎细胞数,并以培养胚胎数为基数,计算2～16细胞、桑椹胚、囊胚的发育率,以囊胚为基数计算囊胚孵化率。 1.2 实验方法 1.2.1 境外精炼 1.2.1. 精子悬浮液的制备 将公绵羊睾丸剪下,在超净工作台内剪碎附睾尾部,将碎片放入吸卵液中悬浮20～30 min,制成精子悬浮液,然后将悬浮液移入10 mL离心管中。吸卵液是在TCM-199(Sigma,eagle氏盐)中添加2%胎牛血清(FCS)、10 mmol/L Hepes (Sigma)和5 IU/mL肝素钠。 1.2.1. 体外受精的制备 精子体外获能采用绵羊血清、肝素孵育法。即用受精基础液将悬浮液中的精子离心洗涤2次(1500 r/min,5 min),用受精液(合成输卵管液80 mL, 绵羊血清20 mL, 肝素钠5 IU/mL)将洗涤后的精子重悬浮,在38.6℃下孵育30 min,使精子获能,用于体外受精。 1.2.2 卵丘细胞细胞 将体外成熟的卵母细胞在0.05%透明质酸酶液中反复吹打洗涤1次,除去部分卵丘细胞,保留2～3层卵丘细胞。用受精液洗涤卵母细胞2次,然后将15～20个成熟的卵母细胞放入受精液滴中(50 μL,上覆矿物油),加入获能精子至5×106精子/mL,38.6℃、5% CO2+95%空气的条件下,培养(体外受精)20 h,用于体外培养。 1.2.3 上覆矿物油/空气混养液l 将体外受精的卵母细胞随机分配到各试验组,每个液滴(50 μL,上覆矿物油)15～20个受精卵,在38.6℃、5% CO2+95%空气的条件下培养,每隔48 h更换2/3培养液。在受精后第7 d检查各试验组胚胎发育情况和胚胎细胞核数量。 1.2.4 核酸数量的测定 将胚胎置于1.0%柠檬酸钠溶液中清洗1 min,用固定液(冰醋酸∶乙醇=1∶3)固定24 h,然后用1.0%间苯二酚蓝醋酸溶液染色、镜检,计算细胞核数量。 1.2.5 统计分析 本实验所得数据均采用卡方(X2)检验进行分析,P0.05为差异显著。 2 结果与分析 2.1 桑虾胚发育情况 由表1可以看出,对照组2～16细胞胚胎的发育率显著高于其它两组(P0.05);各组桑椹胚的发育率没有明显的差异;1组的囊胚率显著高于对照组(P0.05),1组和2组的囊胚率无显著差异;各组都没有出现孵化囊胚。 2.2 桑虾胚发育情况 表2显示,3组2～16细胞胚胎的发育率低于其它3个组,差异极显著(P0.01);各组桑椹胚的发育率没有明显的差异(P0.05);3组的囊胚率显著高于其它组(P0.05),各组都没有胚胎发育至孵化囊胚。 2.3 桑板栗胚的发育情况 表3说明,各组间2～16细胞胚胎的发育率无差异(P0.05