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电喷雾离子化质谱法的研究进展 自1886年帝国理工学院首次提出使用离子源以来，第一块单聚焦质量分析仪的商业化基本上处于理论发展阶段。随后质谱分析在电离技术和分析技术上的发展和完善,使之很快应用于地质、空间研究、环境化学、有机化学、制药等多个领域。随着人类第一张基因序列草图的完成和发展,生命科学的研究也将进入一个崭新的后基因组学,即蛋白质组学时代。正如基因草图的提前绘制得益于大规模全自动毛细管测序技术一样,后基因组研究也将会借助于生物质谱分析技术等得到迅猛发展,这是因为后基因组时代,即功能基因组和蛋白质组计划的实施所必需的高通量、大规模筛选对分析方法又一次提出了挑战。已发展了一百多年的质谱分析技术,由于其所具有的高灵敏度、高准确度、易于自动化等特点,毫无疑问地成为解决上述问题的关键手段之一。 1 量的单电行分子和单荷离子 质谱分析技术( Mass Spectrometry ,MS)是指带电原子、分子或分子碎片按质荷比(或质量)的大小顺序排列的图谱。质谱分析的基本原理用于分析的样品分子(或原子)在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子,进入由电场和磁场组成的分析器,离子束中速度较慢的离子通过电场后编转大,速度快的偏转小;在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转,即速度慢的离子依然偏转大,速度快的偏转小。当两个场的偏转作用彼此补偿时,它们的轨道便相交于一点。与此同时,在磁场中还能发生质量的分离,这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上,不同质荷比的离子聚焦在不同的点上,其焦面接近于平面,在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线,即质谱。通过质谱分析,我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。 2 质量分析技术的分类 2.1 esi法检测多肽序列 美国耶鲁大学化工系教授Yamashita等成功地将电喷雾技术引入质谱离子,并且成功地运用电喷雾电离化质谱对生物大分子进行分析,使电喷雾离子化质谱法得到了充分发展。ESI-MS是众多“软”电离方式中最“软”的一种,它是将消化后的多肽混合物用电喷雾法离子化后进入串联质谱( tandam mass spectrometry) ,从获得的数据中解析多肽序列信息,再通过数据库检索来确定相应的蛋白质。ESI的特点是可以生成高度带电的离子而不发生碎裂,这样可将质荷比(m / z) 降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测到的范围。离子的真实分子量可根据m / z及电荷数计算得到。ESI对复杂蛋白质的分析可达到 attomol,而且测定分子量的上限为150kDa, 具有较高的分辨率,测量精度可达0.005%,对多电荷离子的测定,分子量可达200 000。 2.2 基质辅助激光解吸技术 激光解吸电离质谱(LDI-MS ) 早被作为分析难挥发有机物手段,曾用于分析合成聚合物和热不稳定生物小分子。但K可测分子量均低于3kDa, 对生物大分子测定受到很大限制。直到1988 年Tanaka和Hil1enkamp两个研究组分别提出基质辅助激光解吸电(MALDI-MS,)后才使LDI-MS 应用于生物大分子分析得到发展。MALDl-MS 分析蛋白质的关键是选择合适的基质。首先,基质相当于溶剂,样品分子被基质彼此分开,这种分离削弱了样品分子间相互作用;然后,基质从激光脉冲中吸收能量并转化为固溶体系激发能产生瞬间相变。离子形成过程有两临界值:低表面解吸和高本体解吸,给出离子信号。基质能量传递机制为质子转移和碱金属加合等。基质必须满足一些共性:在合适溶剂中溶解性能,对激光吸收性能,合适反应活性。首先,基质必须在蛋白质溶剂中有好溶解性,常用蛋白质溶剂有盐酸水溶液,水-乙氰/乙醇混合物,70% 甲酸;其次,必须能很好地吸收激光,以使能量沉积在基质中而非分析物上。另外,基质反应活性必须考虑:能对蛋白质或其他分析物起共价修饰或氧化作用的基质不能采用。近期有关基质研究仍很活跃是一热点。用MALDI-MS 分析多肽及蛋白质时,当基质选择妥当之后即着手准备样品。Tanaka等把待测多肽溶于甘油中,并与很细金属粉未混合,然后把悬浮液滴到探头上,让激光照射,再进入质谱分析。甘油对377nm 激光透明,激光与甘油不发生作用。因此,引入金属粉未在溶液中形成吸收中心。Hillenkamp等认为,激光解吸时是底物吸收激光,选择合适基质使之与样品混合就可测量大分子物质,并提出“基质辅助激光解吸”名称。直到选用烟酸作为基质才有突破,烟酸和蛋白质混合溶液滴到探头上,干后用激光照射可得蛋白质分子离子信号。Tanaka法灵敏度为10-9mol 数量级,受关注则相对不多;Hil1enkamp 法灵敏度达10-12 mol 量级,信号强且信噪比