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粘质沙雷氏菌脂肪酶固定化研究 盐酸二二醇是一种具有代表性的钙离子通道阻滞剂的药物，广泛用于心血管疾病的治疗。二二醇有两个中心。传统的化学分离和合成方法需要很好的过程和成本。20世纪90年代，欧洲、日本和美国成功研究了以中学为基础的化学酶法合成二二醇，并进行了工业化生产。合成二硫醇的主要技术（见图1）是由脂肪酶催化分离反四-甲氧基醚磺酸甲醇（（）-pmgm）消旋体获得的合成二硫醇的重要前体（2r，s3）-pmlm。日本的研究人员在中药纤维膜装置中固定了沙核菌sd4100个细胞的外部脂肪酶，并通过该酶催化（）-pmlm的高效分解获得（2r，3s）-pmmm（e.100）。该行业具有良好的应用前景。 酶的固定化是酶工程的核心研究内容之一,通过固定化可以提高酶的热稳定性和操作稳定性,并且酶可以重复使用,从而降低酶的应用成本. 本文对筛选的粘质沙雷氏菌ECU1010脂肪酶进行了固定化研究,比较了游离酶和固定化酶的性质,并在两相搅拌式反应器中利用固定化脂肪酶催化拆分消旋(±)-MPGM, 制备获得了光学纯地尔硫卓的关键手性前体(2R,3S)-(-)-MPGM. 1 实验部分 1.1 粗酶液和酶活力测定 粘质沙雷氏菌ECU1010脂肪酶的发酵按照文献进行. 利用优化后的发酵培养基,预先培养好种子液,然后按5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中,在30 ℃, 150 r/min的摇床上培养24 h. 获得的发酵液在4 ℃以 10 000 r/min离心10 min, 收集上清液即得粗酶液. 酶活力的测定亦按文献方法进行. 取粗酶液100 μl加入到2.87 ml 100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.0)中,在30 ℃保温3 min后加入30 μl 100 mmol/L对硝基苯酚乙酸酯(二甲基亚砜溶液), 于30 ℃,405 nm波长下测定酶活力. 每分钟生成1 μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位. 1.2 固定化酶的制备 脂肪酶在环氧树脂Eupergit C(德国R?hm公司赠送)上的固定化参考文献方法进行,每克载体加入50 ml粗酶液,在25 ℃和150 r/min下吸附24 h, 然后于 10 000 r/min离心10 min, 所得固定化酶用去离子水洗涤3次. 脂肪酶在其它载体上的固定化方法同上,只是吸附时间为12 h. 其中,离子交换树脂D280和D290(购自南开大学化工厂)及硅藻土使用前用0.5 mol/L NaOH洗涤3次,接着用去离子水洗至中性,再用0.5 mol/L HCl洗涤3次,然后用去离子水洗至中性. 其它载体不作预先处理,直接使用. 用0.25%的戊二醛在30 ℃下与上述固定化酶进行交联反应2 h, 然后用去离子水洗3次,得交联的固定化酶. 1.3 活性物质的提取 热稳定性实验: 取100 mg固定化酶悬浮于5 ml Tris-HCl缓冲液(0.2 mol/L, pH 8.0)中,在不同温度下保温6 h后测定残余活力; 取2.5 ml游离酶液,在不同温度下保温6 h后,加入2.5 ml Tris-HCl缓冲液(0.4 mol/L, pH 8.0)调节pH, 随后测定剩余酶活. pH稳定性实验: 游离酶液先用6 mol/L HCl或者6 mol/L NaOH调节至不同pH值, 30 ℃下放置24 h, 然后测定剩余酶活; 固定化酶在30 ℃, 不同pH的缓冲液中悬浮保温24 h, 然后用去离子水洗3次,测其剩余酶活. 储存稳定性实验: 将游离酶和固定化酶(保存在pH 7.5的100 mmol/L磷酸钾缓冲液中)储存于4 ℃冰箱中,每隔一定时间测定酶的剩余活力. 操作稳定性实验: 取固定化酶或固定化-交联酶200 mg, 在甲苯-水两相体系中于30 ℃和150 r/min下反应,甲苯用量为5 ml, 其中含100 mmol/L的(±)-MPGM (本实验室合成), 水相为5 ml Tris-HCl (200 mmol/L, pH 8.0), 反应1 h时取样测定酶活力, 14 h时取样测定转化率; 反应完毕后于 10 000 r/min离心10 min, 回收有机相,弃掉水溶液,然后将固定化酶浸泡于5 ml Tris-HCl (200 mmol/L, pH 8.0)中,室温下保存,次日进行下一次反应,直至剩余酶活力降至初始酶活力的一半左右. 1.4 高效液相色谱法研究低通法氧化底物和底物中的化合物 取交联的硅藻土固定化酶(1 g, 200 U)置于500 ml搅拌式反应器中,加入100 ml Tris-HCl缓冲液(400 mmol/L, pH 8.0)以及100 ml (±)-MPGM的甲苯溶液(0.5 mol/L), 反应在300 r/min和30 ℃下进行,定时取样测定反应转化率以及剩余底物