皂荚多糖胶酶解工艺的研究.docxVIP

皂荚多糖胶酶解工艺的研究 又名胡克、金针、胡韦、沙枣、落叶树、中国最广泛的特效种子，因此也被称为中国胡克。分布在中国河北、山东、山西、福建、江苏、浙江、江西、广东等地。皂荚多糖胶存在于皂荚种子的胚乳中,主要成分为半乳甘露聚糖,相对重均分子质量250000,其分子结构是由β-(1-4)-D-甘露糖构成的主链上,通过α-(1-6)糖苷键连接有单个D-半乳糖形成的支链。目前,皂荚多糖胶主要作为增稠剂、稳定剂和悬浮剂应用于食品、纺织、造纸和石油开采等行业。近年来对大分子多糖进行酸解或酶解的研究表明,水解后的低聚糖不但具有水溶性好、稳定性高、安全无毒等良好的理化特性,还能促进肠道内有益菌群的生长,起到改善肠内菌群平衡、保障人体健康的重要作用。经甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖胶产生的低聚糖为功能性糖类,可作为非营养型食品添加剂,从而促进人体肠道中的有益菌群(双歧杆菌和乳酸菌)增殖,抑制有害菌生长。另外,半乳甘露寡糖在饲料添加剂方面的应用也备受关注,由于半乳甘露聚糖能调节动物非特异性免疫和肠道功能,并且其甘露糖末端还能凝集有害微生物,因而能起到抑制有害菌侵染的作用,因此用半乳甘露低聚糖替代饲用抗生素,对于肉鸡、肉兔和生长育肥猪等的畜牧养殖具有重大意义。将大分子植物多糖水解为功能性低聚糖,已成为大分子多糖开发和应用研究的新热点,这将进一步拓宽植物多糖胶的应用领域,提高皂荚多糖胶的经济效益。 1 材料和方法 1.1 精细化工所需糖的种类 皂荚荚果,由河北涉县供销社提供,经手工剥离获得皂荚种子。采用烘烤脱壳法分离出胚乳,粉碎过120目筛得皂荚多糖胶;皂荚皂素自制;吐温80(分析纯)天津市津科精细化工研究所。 1,4-β-D-甘露四糖(95%)、1,4-β-D-甘露三糖(95%)、1,4-β-D-甘露二糖(95%)标准品爱尔兰Megazyme公司;D-(+)-甘露糖(99%)、D-(+)-半乳糖(98%)标准品美国Alfa Aesar公司。 β-1,4-D-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78),简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase),是一类能够水解含β-1,4-D-甘露糖苷键的内切水解酶,属于半纤维素酶类,由中科院微生物研究所提供。 1.2 仪器、试剂和仪器 2004-211(601)超级恒温水浴锅常州国华电器有限公司;FA1004分析天平、雷磁PHS-25数显p H计上海精密科学仪器有限公司;高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司;UV-2102C型紫外-可见分光光度计尤尼科(上海)仪器有限公司;电热鼓风干燥箱重庆市永生实验仪器厂;HZ9212S恒温振荡器太仓市科教仪器厂;DZTW调温电热套北京市永光明医疗仪器厂;e2695高效液相色谱仪、SUGAR PAK I(65mm×300mm)色谱柱、2414 RID示差折光检测器美国Waters公司。 1.3 方法 1.3.1 酶活力检测 取质量浓度为10g/L的刺槐豆胶溶液(0.1mol/L、p H6.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制)1m L,加入0.1m L用蒸馏水适当稀释的酶液,再加入0.9m L乙酸-乙酸钠缓冲液,于40℃保温反应20min(增加底物浓度会使酶的最适作用温度相应提高),用D NS显色法测定还原糖含量。酶活力单位(U)定义为在40℃、p H6.0条件下,1min催化5mg/m L质量浓度的LBG底物生成1μg还原糖(以甘露糖表示)所需的酶量。经试验测定,β-甘露聚糖酶的酶比活力为448625U/g。 1.3.2 糖基原氨基的测定 还原糖含量:采用DNS法测定;总糖含量:采用硫酸蒽酮法测定。 1.3.3 还原性末端糖基得率测定条件优化正交试验设计 在单因素试验的基础上,选择底物质量浓度(A)、加酶量(B)、反应温度(C)和反应时间(D)作为考察因素,每个因素选择3个水平。以还原性末端糖基得率为参考指标,采用L9(34)正交设计对酶解条件进行优化。用0.1mol/L乙酸-乙酸钠的缓冲溶液(p H6.0)配制皂荚多糖胶溶液,在正交试验设计条件下反应后,立即取出,用DN S法测定还原性末端糖基得率。 1.3.4 皂荚汁浸提液制备 将皂荚的豆荚外壳粉碎过20目筛,用沸程30~60℃的石油醚在45℃抽提6h,每小时至少回流6次。抽提完毕后,挥去石油醚,以料液比1:10加入无水乙醇,在60℃浸提皂荚粉1h,浸提操作在上述条件下重复1次。用旋转蒸发仪回收无水乙醇,将所得浸膏在真空干燥箱中干燥后,再用40℃无水乙醇溶解,重结晶,结晶操作重复进行3次,得到微黄色皂荚皂素结晶,纯度为81.5%。 1.3.5 碱土石碳系减水剂的复配 50g/L皂荚多糖胶配制完成后呈凝胶状,几乎无流动性。当按照β-甘露聚糖酶与多糖胶比例为1300U/g加入β-甘露聚糖酶后,皂荚多糖胶的黏度快速下降,变为液体状态,流动性能得