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低氧条件下肝细胞生长因子对胃癌细胞侵袭和迁移的影响 肝生长因子（hgf）是间质源的多效生长因子。对于有强大的推广分裂、组织形成、上皮细胞迁移、袭击和血管生成，起到了很好的作用。乙酰肝素酶蛋白 (HPSE) 是一个重要的胞外基质降解酶, 它与转移性恶性肿瘤关系密切, 高转移潜力的恶性肿瘤高表达HPSE, 低或无转移潜力的恶性肿瘤微量或不表达。本实验采用低氧与HGF处理胃癌细胞, 观察其HPSE蛋白的表达及对其侵袭力的影响。 1 材料和方法 1.1 培养基和试剂 人胃癌细胞株SGC-7901由河南科技大学肿瘤研究所提供, RPMI1640培养基, 胎牛血清购自Hyclone公司, HGF购自Peprotech公司, 兔抗人HPSE单克隆抗体购自武汉博士德公司, 免疫组化试剂盒购自SantaCruz公司。 1.2 hgf对小鼠细胞的生长 细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液中, 实验所用细胞均处于对数增长期。分为常氧组 (空气, 5%CO2) , 低氧组 (5%O2、5%CO2、90%N2) 每组分别给予0, 40ng/ml的HGF, 培养温度均为37℃, 湿度均为100%。各组细胞在相应氧环境中培养48h后, 进行各项指标测定。每组重复6次。 1.3 流式细胞术检测细胞数 在传代时将10mg/L纤维连接蛋白处理的盖玻片置于培养板中, 待细胞长满后, 更换新鲜培养液, 将各组细胞置于不同氧环境中, 培养48h后, 取出盖玻片, 放入培养板中, 常氧培养48h后在显微镜下计数, 以刮除线为起始线, 沿迁移方向单位面积内的细胞数作为计量指标。 1.4 细胞穿膜与化学检测 采用Boyden小室检测SGC-7901细胞穿透人工重组基底膜 (穿膜) 的能力。采用24孔法。8μm孔径的聚碳酸酯微孔滤膜上均匀涂布一层含1%胎牛血清的1640培养基稀释的Matrigel胶作为人工基底膜, 37℃孵育3h, 铺于上室。将下室各孔分别加入400μl培养液。上室加入各组细胞悬液100μl (1.5×105) , 每组3个复孔。37℃、5%CO2培养18h, 取出膜, 磷酸盐缓冲液冲洗, 苏木精染色, 200倍光镜下随机选择8个视野计数, 取其平均值作为穿膜细胞数。1.5免疫细胞化学方法检测将经消毒的直径20mm盖玻片置于90mm培养皿中, 按2×104/ml细胞接种, 48h后给予各组不同条件处理, 培养48h, 行免疫细胞化学检测。PBS清洗, 冰丙酮固定, 用TritonX 2100孵育, 3%H2O2孵育, 血清封闭, 再加一抗HPSE于37℃作用1h, 二抗37℃作用0.5h, DAB显色, 苏木精复染, 树胶封片。染色结果采用HPLAS-100彩色图像分析系统进行分析, 表达强度用平均吸光度值表示。 1.6 统计学处理 数据以x±s表示, 采用SPSS12.0软件进行统计学处理, 多组间均数比较用方差分析, 两组间均数比较用t检验, 以P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 hgf对小鼠细胞迁移力及侵润力的影响 低氧组细胞迁移力及侵润力均显著高于常氧组 (P0.05) , 而经HGF处理后细胞迁移力及侵润力均显著高于未经HGF处理组, 在低氧状态下HGF处理后细胞迁移力及侵润力明显增强 (P0.05) 。见表1。 2.2 两组hpse蛋白表达比较 低氧组、低氧HGF处理组HPSE蛋白表达为 (0.56±0.04) , (0.78±0.01) , 常氧组, 常氧HGF处理组HPSE蛋白表达为 (0.18±0.05) , (0.31±0.06) , 其差异有统计学意义 (P0.01) 。 3 低氧和hgf作用的机制 低氧与肿瘤的恶性转化、转移及治疗抗拒性有关, 肿瘤细胞对低氧的适应能力是许多实体瘤的共同特征。在微血管密度增加的基础上, 肿瘤快速生长。肿瘤血管在结构和功能上的异常, 使肿瘤组织的血液灌注呈现空间和时间上的异质性。随着瘤细胞微环境的改变, 肿瘤细胞快速生长, 局部血管无法供应肿瘤所必需的氧气及营养, 继发的组织低氧则抑制细胞的分化或直接导致细胞死亡, 结果使那些适应低氧环境和低血糖的残存细胞继续生长, 从而导致恶性程度增高和 (或) 转移。HGF主要由间质细胞衍生的多功能细胞因子, 通过自分泌或旁分泌的形式作用于数种上皮源性的细胞 (如肝细胞、肾小管上皮细胞) , 诱导细胞有丝分裂、刺激细胞移动并且对抗细胞因子诱导的凋亡。 本研究证实, 低氧条件下, HPSE的表达增强, 而且伴随迁移能力和侵袭力的增强, HPSE是一种β-D葡萄糖醛酸酶, 它可切断乙酰肝素蛋白多糖的HS侧链, 降解细胞外基质和基底膜。临床研究表明HPSE的活性增加意味着侵袭力的增加和预后差, 因此HPSE在体内的活性变化。 可能会受组织细胞