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基于r-pcr技术检测rebd-1rna在品种间的表达 近年来，在植物和自然界（囊性动物、昆虫、鱼类、两栖动物和哺乳动物）中发现了一套具有抗菌作用的多功能茶多酚，称为抗菌酶。它们参与了抵抗微生物侵害的最初宿主防御活动,是内源性免疫体系的成分。防御素是生物体抵抗病原微生物的防御反应过程中产生的一类短肽,是抗菌肽中一个大家族。防御素分子既可亲水也可亲脂,能与病原微生物细胞膜的磷脂结合,破坏细胞膜,从而杀灭微生物。 防御素是一组小分子量(3.5～4.5 kd)、分子内富含半胱氨酸的阳离子抗微生物短肽。其结构的主要特征是由3～4个分子内二硫键组成的β-片层结构。根据分子结构特征和来源的不同,防御素可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素5种类型,其中α、β、θ-防御素存在于哺乳动物的组织细胞中,昆虫防御素和植物防御素分别表达在昆虫和植物体内。 β-防御素由哺乳动物的皮肤、粘膜等上皮细胞产生,分布在宿主机体与环境的界面位置,构成机体抵御外界微生物侵袭的第一道化学屏障。迄今为止,β-防御素是唯一可以在多种组织的上皮细胞内表达的防御素。在不同种属哺乳动物的上皮细胞中已经发现了多种β-防御素,为了检测驯鹿体内防御素的表达,进行了本研究。本试验采用反转录PCR(RT-PCR)技术检测驯鹿体内可能表达reBD-1mRNA的器官,以阐述β-防御素reBD-1在驯鹿体内的分布范围。 1 pcr引物的设计与合成 成年雄性驯鹿一只由根河市敖鲁古雅乡鄂温克猎民提供。驯鹿屠宰后立刻取舌、食管、瘤胃、网胃、皱胃、十二指肠、回肠、结肠、气管、膀胱的黏膜组织,并切取适当量的肝、肺、肾、睾丸、附睾、心脏、脾脏组织,立刻放入液氮中备用。 DL2000 DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司;琼脂糖、总RNA提取试剂盒、一步法反转录PCR试剂盒购自Promega公司。 根据本研究组已克隆的reBD-1cDNA序列,利用计算机软件DNAstar设计了一对PCR引物P1和P2。另外根据驯鹿18S rRNA序列设计的另外一对PCR引物P3和P4。引物由上海生工生物工程公司合成。 上游引物P1:5′-CCA TAG GAA TAA AGG CGT CTG TG-3′ 下游引物P2:5′-GCC GTG TCT TCA TCT TCT TTT ACT T-3′ 上游引物P3:5′-CCC GGA GAA GGA GCC TGA GAA AC-3′ 下游引物P4:5′-TGA TGC CCC CGA CTG TCC CTA TTA-3′ 采用Promega总RNA提取试剂盒,按其说明分别提取驯鹿舌、食管、瘤胃、网胃、皱胃、十二指肠、回肠、结肠、肝、肺、气管、肾、膀胱、睾丸、附睾、心脏、脾脏的总RNA,最后用无RNase水溶解RNA沉淀,-70℃保存备用。 另外为了检测所提取的驯鹿各器官RNA的完整性,各设一个内参照,即在上述RT-PCR反应液中不加入P1和P2,而是加入同等量的另一对PCR引物P3和P4。RT-PCR反应条件为:48℃保温45 min,使RNA逆转录为cDNA;94℃预变性2 min,然后进行35个PCR循环:90℃30 s,55℃退火1 min,68℃延伸2 min;最后68℃延伸7 min。 2 bdp的扩增带 RT-PCR反应后,经1%琼脂糖凝胶电泳检查,在驯鹿的舌、食管、瘤胃、网胃、皱胃、十二指肠、回肠、结肠、肝、肺、气管、肾、膀胱、睾丸、附睾、心脏、脾脏黏膜组织内均有约121 bp的一条扩增带,其中舌、瘤胃、睾丸有较强的扩增带;在食管、十二指肠、空肠、结肠、气管、脾脏中的扩增带较弱;在皱胃、网胃、回肠、肝、肺、肾、膀胱、附睾、心脏中的扩增带很弱(图1)。 为了检测所提取的驯鹿各器官RNA的完整性,我们根据18S rRNA序列设计了一对预计PCR扩增产物为501 bp的引物P3和P4,以驯鹿的17种器官总RNA作为模板,通过RT-PCR技术获得其产物,经1.2%琼脂糖凝胶电泳检查,所有被检驯鹿组织均在约501 bp处有一条扩增带(图2),说明以上所用各器官的RNA的结构是完整的。 3 -防御素在非上皮组织器官内的表达 动物机体的上皮组织是抵御入侵微生物的第一道防线,虽然它们经常暴露在有微生物存在的环境下,但很少发生感染,即使发生感染其范围也通常是局部的。已有研究证明脊椎动物的上皮组织不仅可作为物理屏障,而且还能产生一类有效杀灭各种微生物的抗微生物蛋白(Bomam,1998;Boman,1995),后来又发现大多数脊椎动物的上皮组织还能产生具有广谱抗微生物活性的抗微生物肽(Hecht,1999;Bals,2000)。这些抗微生物蛋白和肽不仅有助于动物机体的先天性免疫,而且有助于机体的适应性免疫(Yang D,1999)。 防御