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石蜡包埋法制作植物叶片的创新研究 在生物教育和生物形态结构的研究中，没有必要使用显微镜观察。显微镜观察的材料必须能穿透，并配置在一定规格的玻璃上，也就是说，需要制作玻璃样品或微样品。植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术, 使人们认识植物体结构的有效手段, 已成为植物生物学的重要组成部分。切片技术是生物科学工作者特别是植物学工作者常用的一种实验手段。随着各种新仪器的问世和新技术方法的不断建立与使用, 石蜡切片技术也逐渐扩展、渗入许多新领域中, 做为基础技术提供有效的实验或使用样品。石蜡包埋组织切片还可用于细胞原位核酸分子杂交技术中, 可对材料中被杂交的DNA分子进行定位、含量分析或观察基因表达 (m RNA) 水平;聚合酶链式反应 (PCR) 技术可用于固定、石蜡包埋组织的DNA分析, 使研究进入了分子水平, 但在短期内这些技术尚不能做常规使用。迄今为止, 植物制片技术已建立了许多方法, 多采用的有徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡切片法等, 其中最常规的为石蜡切片法。然而采用常规石蜡切片法包埋及染色所需的时间太长、太繁琐, 有些质地过硬的材料也不宜使用。本研究同样采用此方法, 并在方法上进行了一些改进, 其周期短成为该法的显著特点, 8-10天即可完成整个制片过程, 同时还节省了试剂。 1 设备和试剂 1.1 玻片的制作 石蜡切片机、烘箱、切片刀、恒温展片台、蜡杯、酒盅若干、酒精灯、蜡铲、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、台木、树胶、脸盆、包埋纸盒、吸管、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 1.2 聚苯胺faa系列 1%番红、1%固绿、各浓度的酒精 (无水乙醇、95%、85%、80%、70%、50%、30%) 、FAA固定液、二甲苯、石蜡、埃利希苏木精染液、郝普特氏粘片剂、蒸馏水、中性树胶等。 2 材料的固定 选择植物健康、标准、具代表性的部分。如果不是为了特别目的, 不能用一些病态的不正常的材料。采下的材料应尽快浸入固定液固定。本实验采用几种针茅 (Stipa.) 的叶片进行石蜡制片, 材料直径1mm左右, 长0.8-1.0cm。 3 实验步骤 3.1 faa固定液对针茅叶片固定的影响 所截取得材料应迅速投入固定液。选择固定液的原则就是用药品把细胞杀死, 使细胞的原生质凝固, 死后不发生变化, 尽可能保持原来的结构以供我们观察。良好的固定剂, 应是穿透力强, 使细胞立刻致死, 原生质全部凝固;不发生任何变形, 增强折光率, 并且不妨碍染色。因此植物材料不同, 应选择不同的固定液。我们选择FAA固定液对针茅叶片进行固定, FAA固定液是最常用的一种固定液, 其用量最少应为所固定材料的总体积的20倍, 应该使植物材料四周都能浸泡在固定液里, 这样能在短时间里使固定液浸透材料。 植物材料固定后, 若不立即制片, 可以保存在固定液中, 或转至70%酒精溶液中保存。 3.2 反压梯度和浸泡时间的确定 将材料从固定液中取出后, 进行植物材料脱水, 其具体流程如下: A:酒精X:二甲苯 设置浓度梯度是为了防止材料皱缩, 但具体浓度梯度和浸泡时间要视材料情况而定, 对于幼嫩的材料, 梯度要大些, 各步浸泡时间可短些, 老的硬的梯度则要小些, 各步浸泡时间则相应要长些。第二次100%A脱水很关键, 一定要确保水脱尽。 3.3 控制温度,调ph 将透明的材料用镊子取出放进蜡杯中, 再把碎石蜡 (熔点48-50℃) 用蜡铲放到蜡杯2/3为止, 加盖放入37℃温箱, 放置24 h进行溶蜡。24小时后去掉蜡杯的盖子, 之后再将温箱温度调至56℃放置5天, 使其透明剂充分挥发。 取若干个酒盅将材料转移至盛有熔点为60-62℃石蜡的酒盅里, 温箱温度调到70℃, 2h换一次熔点60-62℃的石蜡, 换三次即可进入包埋程序。 3.4 包埋 3.4.1 包装并嵌入盒子 包埋前应先准备包埋用的纸盒。纸盒用较硬而光滑的纸折成, 大小根据植物材料的大小而定, 这里用6cm×1cm×1cm的纸盒。 3.4.2 整地、冷却 将纯石蜡倒入小纸盒, 用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐并使其竖直, 进行包埋。稍微凝固后倒置于清水盆中彻底冷却凝固。在常规石蜡包埋中最困难的是碎小组织、纤细叶片的包埋, 可以在纸盒里倒入少许的石蜡, 是材料基部固定住后, 再倒石蜡至完全覆盖住材料。 3.5 材料之心理面为小块。请看材料的厚度 将包埋好的材料从摆卖纸盒里拖出蜡块, 用双面刀片切割成小块, 刀片不宜太厚, 以免材料从蜡块中脱落。每个小块包含一个材料, 并修成梯形, 切面在梯形的上部。注意上部矩形对边平行, 梯形底部用烧热的蜡铲将其固定在木台 (2cm×2cm×2.5~3cm) 上, 植物材料的切面与木台的粘贴面平行。 3.6 动调控调切