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石耳地衣黑化真菌的分离鉴定 来自地衣体的非地衣共生菌是一个非常大的群体，但相关研究非常有限。这些研究主要局限于地衣来源真菌的物种多样性调查。尽管许多地衣来源真菌的系统位置被证明与植物内生真菌有关,并被称为地衣内生真菌,但是考虑到地衣与植物的明显不同,我们还需要做更多的研究去证实地衣内生菌是否仅仅是植物内生菌的延伸。 本研究专门调查了分离自中国和美国的石耳目(Umbilicariales)地衣的非地衣共生真菌。这些真菌都是黑色和不育的。为了探明它们的系统位置,我们基于ITS nrDNA 序列(包括ITS1, 5.8s and ITS2),分析了这些来自石耳目地衣的黑化真菌和GenBank中相关真菌的系统发育关系。结果显示这些黑化真菌可能是石耳目地衣体内的稳定定植者,而且与自由生活的石生真菌具有很近的亲缘关系,并非是植物内生菌的延伸。 1 材料和方法 1.1 umelicara和lasalia的标本 石耳目地衣于1994～2004年采自中国河北、吉林、新疆、云南、美国田纳西州和阿巴拉契亚山,包括7种Umbilicaria的13份标本,5种Lasallia的6份标本和2份Boreoplaca ultrafrigida标本(表1)。标本采集后于-20℃下保藏,并在30 d内处理完毕。本研究所涉及的地衣标本现保存于中国科学院微生物研究所地衣标本馆(HMAS-L)。 1.2 黑化菌株的培养 本研究所涉及的黑化真菌是采用Yamamoto法分离地衣共生菌过程中额外获得的。菌落长出后,转至PDA斜面培养基上,18℃下培养。为了诱导产孢,黑化菌株在光照/黑暗(12 h∶12h)条件下,于2%的PDA培养基上,18℃下培养3个月。所有菌株都保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。 1.3 pcr扩增 CTAB法提取真菌基因组DNA,采用成对引物进行ITS nrDNA(包括ITS1,5.8S和ITS2)的PCR扩增。引物设计如下:1R:5′-TATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′; P13:5′-GGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3′。PCR反应体系为50 μL:DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,10×PCR缓冲液(含有MgCl2)5 μL,dNTP 5 μL(2.5 mmol/L),模板DNA 1 μL(100 ng/μL),引物各1 μL(10 μmol/L),加双蒸水至50 μL;反应条件为:95℃预变性3 min,94℃变性30 s;52℃退火30 s,72℃延伸30 s,共进行37个循环,最后72℃延伸10 min使其完全反应。以PCR产物进行测序,由北京华大基因研究中心完成。测得的ITS序列用DNAMAN 4.0进行处理后,均已经提交到GenBank(图2)。 1.4 多重序列比对 利用BLASTn将黑化真菌的ITS nrDNA序列在GenBank中进行相似性搜索,获得相关序列;用ClastalX 1.83进行多重序列比对;使用MEGA4.0软件对比对结果进行人工校正;运用MEGA4.0软件中的最小进化法(Minimum Evolution,ME)构建系统发育树,并进行1000次重复的自展检验(bootstrap)。 2 上皮尔克氏原螯虾3株的进化支出分析 从采自中国和美国的石耳目13个种的21份地衣体中,共分离得到33株黑化真菌。其中,从7种Umbilicaria的13份地衣中获得21株菌;从5种Lasallia的6份地衣中获得10株菌;从Boreoplaca ultrafrigida的2份地衣中获得2株菌。经诱导,33株菌株均未能产孢。菌落形态见图1(由于同种真菌菌落形态特征基本相同,这里只选择了33个菌株中有代表性的12个菌落)。 测定了上述33株菌的ITS序列。通过相似性搜索,自GenBank中获得了19个真菌的相关序列。选择了Eurotium chevalieri(Trichocomaceae,Eurotiales, Eurotiomycetes,Ascomycota),Monascus rutilus(Monascaceae,Incertae sedis,Eurotiomycetes,Ascomycota)和2种Dermatocarpon(Verrucariaceae, Verrucariales, Eurotiomycetes, Ascomycota)作为外类群。 该56条序列均为完整的ITS序列。系统发育分析结果见图2。 系统发育树的拓扑结构显示:从石耳目地衣中获得的33株真菌分布于A～H 8个进化分支中。这些进化分支都获得了高度的自展支持(99%～100%)。 A支由来自Umbilicaria yunnana、U.vellea和Lasalliasp.2的7株菌与来自G