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腺胃型鸡传染性支气管炎病毒分离株的分离鉴定 鸡感染综合征（ib）是由鸡感染综合征（ibv）引起的一种急性、高度接触性传染病。自1931年首次报道了以呼吸道病变为主的鸡传染性支气管炎呼吸道病变型以来, 临床上不同组织嗜性的传染性支气管炎病毒毒株不断地被分离和鉴定出来, 先后出现了嗜肾型、嗜肠型毒株。1994年以来, 我国的山东、江苏等省出现了腺胃型鸡传染性支气管炎病毒, 并一直在国内呈流行趋势。笔者从黑龙江省某鸡场的病死鸡腺胃组织中分离到1株腺胃型鸡传染性支气管炎病毒, 现报道如下。 1 材料和方法 1.1 fps鸡、rnafast200试剂盒 病料, 采自黑龙江省某发病鸡场病死鸡的腺胃组织。10日龄SPF鸡胚和14日龄SPF鸡, 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。RNAfast200试剂盒, 购于上海飞捷生物技术有限公司;DEPC、dNTP、rTap酶、M-MLV鼠源反转录酶、RNA酶抑制剂等, 购于宝生物工程 (大连) 有限公司。 1.2 方法 1.2.1 冻融法提取糖液中亚硝酸盐 无菌采集病死鸡肿大的腺胃组织, 按1∶5的比例加入无菌PBS, 匀浆后制成乳悬液, 反复冻融3次, 4 000 r/min离心30 min;取上清液用0.22 μm滤膜滤过除菌, 加入青霉素1 000 IU/mL、链霉素1 000 μg/mL, 4 ℃过夜;用普通肉汤培养基无菌检验, 备用。 1.2.2 尿囊液的分离和测定 取无菌检验阴性的接种材料经绒毛尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚, 每胚接种0.2 mL, 于37 ℃温箱孵育, 弃去24 h内的死亡鸡胚;将36～48 h死亡胚和部分活胚置4 ℃冰箱过夜;无菌收获尿囊液, 经无菌检查后用小瓶分装用于传代, 其余置-70 ℃冰箱中保存。同时留数只活胚至18～19日龄, 观察胚体的变化。将以上尿囊液用无菌PBS做1∶10稀释, 盲传至第8代。 1.2.3 病毒血凝度的测定 取第5代鸡胚尿囊液分为两份, 一份按常规方法作HA试验;另一份用1%胰酶37 ℃处理4 h, 再按常规方法作HA试验。 1.2.4 min的测定 取第5代鸡胚尿囊液以8 000 r/min离心30 min;取上清液, 27 000 r/min高速离心3 h;用PBS重悬沉淀, 进行磷钨酸负染后, 电镜下观察是否有病毒样粒子的存在。 1.2.5 引物的设计 参照Zwaagstra K A等的报道, 在鸡传染性支气管炎病毒 N基因5′末端的一段保守序列合成了1对引物, 跨度为438 bp。上游引物IBVN1-5′-GTCTTGTCCCGCGTGTA-3′, 下游引物IBVN2+ 5′-ACCCTTACCAGCAACCC-3′。使用RNAfast200试剂盒从第5代鸡胚尿囊液中提取病毒RNA, 随后进行RT-PCR, 具体方法参照参考文献。 1.2.6 鼻接种第5代病毒尿囊液2.3ml/只,2组接种剂量4.3.2 选择14日龄SPF雏鸡20只, 平均分为2组:第1组经点眼、滴鼻接种第5代病毒尿囊液0.3 mL/只, 第2组接种等量灭菌生理盐水作为对照。隔离饲养观察15 d, 记录发病情况, 对发病鸡和死亡鸡进行剖检, 同时采集组织脏器等病料再次进行病毒的分离。 2 结果 2.1 第4代鸡胚发育情况 随着分离毒在SPF鸡胚上盲传代数的增加, 鸡胚矮小、卷缩的现象愈加明显, 死亡规律更加典型。当传至第4代时, 部分鸡胚发育受阻, 出现侏儒胚;传到第5代时, 绝大多数鸡胚出现矮小、卷缩现象, 平均胚重10.2 g, 远低于健康组鸡胚的18.7 g, 并且死亡胚数量明显增加。 2.2 病毒血凝度测定的结果 分离株各代尿囊液对1%鸡红细胞不发生凝集, 但经1%胰蛋白酶处理后出现血凝活性, 第5代毒的血凝效价为28。 2.3 鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡鸡菌的分离鉴定 电镜观察可见大小为80～120 nm、多呈球形、有囊膜的病毒颗粒, 其表面有呈松散状均匀排列的冠状突起, 与冠状病毒粒子的基本形态相符, 初步鉴定所分离病毒为鸡传染性支气管炎病毒。 2.4 r-pcr检测结果 用RT-PCR扩增分离毒与阳性对照M41株N基因片段, 均获得大小约为438 bp的目的片段。结果见图1。 2.5 分离鸡腺胃变化 分离株第5代尿囊液接种14日龄SPF雏鸡, 接种3d内未见明显的发病症状;第4天部分鸡只开始出现食欲减退、拉稀等症状;第5天全部鸡只发病, 表现为精神萎顿、拉稀和轻微呼吸道症状;接种后第6天开始出现死亡, 至接种后第10天死亡3羽, 死亡率达30%。剖检病死鸡和发病