中药佐剂对新城疫疫苗免疫鸡淋巴细胞转化和血清抗体效价的影响.docxVIP

中药佐剂对新城疫疫苗免疫鸡淋巴细胞转化和血清抗体效价的影响 我确认了免疫助剂对疫苗的免疫效果。然而，使用的大多数药物，如油乳液、铝橡胶，存在着副作用大、残余时间长、身体吸收缓慢等缺点。随着人们对绿色畜产品的迫切需求,研制开发来源广泛、效果显著、毒副作用小的新型免疫增强剂越来越受到人们的重视。我们以前的研究发现,多数中药成分与疫苗共用能显著提高血清抗体效价、促进淋巴细胞转化,而复方中药成分的增强免疫作用尚未见报道。本研究选用黄芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)、淫羊藿多糖(epimedium polysaccharide, EPS)、蜂胶黄酮(propolis flavone, PF)和人参皂甙(ginsenoside, GS )等4种中药成分组成2个复方,各分3个剂量与新城疫疫苗混合后免疫雏鸡,以无佐剂苗和油乳苗为对照,测定免疫后外周血T淋巴细胞转化和血清新城疫抗体效价的动态变化,旨在探讨复方中药成分作为免疫增强剂的可能性。 1 材料和方法 1.1 中药成分的检测 APS、EPS和PF,均由本研究室提取和测定含量;GS,吉林省亚威制药厂产品。取4种中药成分按照不同配比组成2个复方,按高、中、低3种剂量用等量去离子水稀释,其中方1的3种剂量的中药成分总含量分别为0.75、0.375和0.187 5 mg,方2为 3.75、1.875和0.937 5 mg,高压消毒后备用。 1.2 水处理和生物活性材料 RPMI1640培养基,Gibco公司产品,按说明书用三蒸水配制,过滤除菌,分装,4℃保存,临用前加小牛血清(杭州四季青生物制品厂)达10% 和常规量的双抗。植物血凝素(PHA),用RPMI1640培养液配成0.1 g/L。四甲基偶氮唑蓝(MTT),Amresco公司产品,用pH7.4的PBS液配成5 g/L的溶液,0.22μm的微孔滤膜过滤,避光保存。淋巴细胞分离液,上海恒信化学试剂有限公司产品,批号030728。裂解液,二甲亚砜(DMSO),分析纯,苏州正兴化工研究院产品。新城疫标准抗原,由江苏省农业科学院兽医研究所提供。 1.3 材料、仪器和仪器 DG-3022型酶联免疫检测仪,国营华东电子管厂产品。CO2培养箱,美国Revco公司生产。XSZ-D2型倒置显微镜,重庆光学仪器厂生产。75-2A型微量振荡器,上海医用分析仪器厂生产。96孔细胞培养板,德国Nunclon公司生产。 1.4 中药佐剂苗的配方 新城疫尿囊液,由江苏省农业科学院兽医所提供,血凝价为210。取原液加3倍量无菌生理盐水稀释作为无佐剂苗;加3倍量各复方中药成分制成中药佐剂苗;按文献制备成油佐剂苗。保持各疫苗每头份中抗原的含量相等。 1.5 免疫t细胞转化 1日龄非免疫健康罗曼蛋公雏270只(购自南京汤泉农垦种鸡场)随机均分为9组,分别为方1、方2的高、中、低剂量组、无佐剂对照组、油佐剂对照组和空白对照组。17日龄(平均体质量125 g/只,平均母源抗体效价3.5 log2)时,前8组分别注射相应疫苗(0.5 mL/只),空白对照组注射等量生理盐水。分别于免疫后7、14、21、28、35 d每组随机抽取4只,心脏采血(4 mL/只),肝素抗凝,测定外周血T淋巴细胞转化;同时(包括免疫后42 d),每组随机抽取10只翼下静脉采血,分离血清,用β-微量法检测新城疫血凝抑制(hemagglutination inhibition, HI)抗体效价。 1.6 营养液洗后离心 用MTT法。将抗凝血样用Hanks′液稀释1倍,小心加在淋巴细胞分离液上层,2 000 r/min离心20 min,吸取中间云雾状白细胞层,用无血清RPMI1640营养液洗2遍,1 500 r/min离心10min。活细胞计数后,用RPMI1640 培养液调整细胞密度为5×106个/mL,加入到96孔细胞培养板中,80 μL/孔,每孔再加20 μL PHA,每个样品重复4孔,然后置39.5℃、5%CO2培养箱中培养44 h,每孔加MTT 20 μL,继续培养4 h后,吸去上清液,每孔加DMSO 100 μL,将细胞板置微量震荡器上震荡5 min使沉淀完全溶解,在酶联免疫仪上检测570 nm处的吸光(D570)值,作为T淋巴细胞转化的指标。 1.7 处理数据 数据以平均值±标准差表示,用SPSS软件统计分析,比较各时间点T淋巴细胞转化和抗体效价的差异性。 2 结果 2.1 个中药佐剂组不同给药剂量对d值的影响 见表1。免疫后7 d,方1高组、方2中组和方2低组D值显著高于无佐剂对照组和油佐剂对照组(P0.05);14 d,6个中药佐剂组D值均显著高于无佐剂对照组和油佐剂对照组(P0.05);21 d,方1高组、方2高组和方2中组D值显著高于无佐剂对照组(P0.0