岷江百合根尖染色体的荧光原位杂交分析.docxVIP

岷江百合根尖染色体的荧光原位杂交分析 李岷江花园建于四川，又名王白河。生于海拔800~2 500米的河旁和山坡岩石边,为百合属百合组的鳞茎球根花卉,是多年生草本,花大喇叭型,花色为纯白色,花朵平展不垂头,园艺观赏价值高(汪发缵和唐进,1980)。岷江百合对于病毒病害具有较强的抗性,是优良的育种亲本,正是由于岷江百合的引入,才使得欧洲百合在困于病毒蔓延,濒临灭绝惨景下,又重放光彩。在国内百合育种中,岷江百合也是一直为育种者所重视的杂交亲本,20世纪80年代,上海园林科研所曾用岷江百合(L.regale)与玫红百合(L.amoenum)进行种间杂交,培育出花浅玫瑰红色具有鲜红斑点的杂交种;王百合与兰州百合(L.davidii var uicolor)种间杂交,培育出生长旺盛,花橙红色的杂交种。与此同时,中国科学院北京植物园亦开展了王百合×兰州百合、王百合×山丹和铁炮百合×山丹的种间杂交。由于杂交组合较少,工作开展的持续性不够,所以至今国内还缺少自育的商业品种(张延龙和牛立新,2002)。 百合属于大型染色体,是研究遗传与进化的好材料。在现代分子育种过程中,追踪不同种间染色体的行为,建立染色体变化与重要观赏性状之间的关联,是育种学家一直所努力的。此前对岷江百合染色体也主要是对核型的研究,通过核型分析来揭示百合变异式样及变异规律。前人的研究表明在常规染色体水平上,虽然看到了岷江百合不同居群间染色体明显发生了结构变异,但却难以准确定位具体的哪几条染色体发生了断裂、缺失、倒位和易位(王红霞和杨保胜,2003)。 本研究对岷江百合的染色体进行了Giemsa C-带和FISH分析,旨在为岷江百合杂交育种和杂种后代提供有效的鉴定方法和手段。 1 材料和方法 1.1 材料表面 本研究所用的岷江百合(Lilium regale)采集于四川岷江流域。45S rDNA克隆于水稻,由南京农业大学王秀娥教授馈赠。 1.2 预处理、解离 染色体C-分带参照Gill等(1991)的方法进行,略有改动。剪取岷江百合长度约1.5~3 cm的幼嫩根尖,置于盛冰水的10 mL离心管中,放入冰水混合物中预处理。预处理时间选择24 h、36 h和48 h,三个梯度。卡诺氏固定液(95%乙醇:冰醋酸=3:1)固定。在压片之前先将固定好的根尖于45%醋酸中解离,解离时间根据根尖的粗细分为0.5 h,1 h和2 h三个梯度,45%醋酸压片,在相差镜下镜检。取染色体分散良好的制片,放入-70℃冰箱冰冻2 h后揭片,无水酒精脱水6 h以上,气干,备用。 1.3 fishergiemsa染色法 将上述处理好的制片在预热至60℃的0.2 mol/L HCl中处理2.5 min,蒸馏水冲洗,转入沸水溶解后冷却至室温(20~25℃)的过饱和(7%)的Ba(OH)2溶液中处理7 min。将制片流水冲洗干净,再放入预热至60℃的2×SSC溶液60 min,然后将制片直接移入磷酸缓冲液(p H 6.8)稀释的Fishers Giemsa染液中染色至适度,取出制片用蒸馏水冲洗,气干。63×镜下观察并照相。C-分带分析参照李懋学和陈瑞阳(1985)的方法进行,将C-带,根据其分布位置,分为5种类型,即着丝点带(centromeric band)、中间带(intercalary band)、末端带(telomere band)、次缢痕带(secondary constriction band)和随体带(satellite band),并分别记做C、I、T、N和S,若带位于长臂上则在字母的右侧下标为“+”,若在短臂上有带,则在右侧上标为“+”,若长短臂上都有带,则不需要注明。利用Giemsa C-分带的方法对收集到的百合材料进行了分析,对各条染色体进行了鉴定,并将每个材料的染色体按A-L进行描述(Stewart,1947)。 1.4 染色原位异交fish 1.4.1 基于antyl的胃蛋白酶解法 染色体制片的方法与Giemsa C-带相同,酶解方法参照(Lim,2000;Lim and van Tuyl,2002)的方法,略有改动。将揭片脱水气干后的制片于RNA酶Ⅰ溶液中(100μg/μL),37℃酶解1 h;转入胃蛋白酶溶液(4%)中,37℃酶解10 min;4%的多聚甲醛溶液中,室温处理10 min;70%、95%、100%乙醇中梯度脱水,各3 min,气干,备用。 1.4.2 先加入未加入2.3%氧化液5.5% (1)反应液配制:将离心管置于冰上,依次加入: (2)反应液混匀,15℃温育2 h。 (3)加入EDTA(p H8.0)5μL,-20℃冰箱保存备用。 1.4.3 混合 (1) 制备混合溶液2 将杂交液混匀,100℃沸水中变性10 min后,立即置冰浴中10 min以上。 (2) 水处理